זיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבונים באמצעות פפטיד מערכים
Summary
Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.
Abstract
אינטראקציות בין חלבונים לתווך את רוב התהליכים בתא הומאוסטזיס ושליטה חיים של האורגניזם. אינטראקציות חלבון פגומות עלולות לגרום למחלה, מה שהופך את אינטראקציות חלבון מטרה לתרופות חשובות. מכיוון שכך, חשוב מאוד להבין האינטראקציות הללו ברמה המולקולרית. אינטראקציות חלבון נלמדות תוך שימוש במגוון של טכניקות הנעות בין מבחני סלולריים וביוכימיים למבחנים ביו-פיסיקליים כמותי, ואלה עשויים להתבצע גם עם חלבונים באורך מלא, עם תחומים חלבון או עם פפטידים. פפטידים לשמש כלי מצוין כדי לחקור אינטראקציות חלבון שכן הוא יכול להיות מסונתזים פפטידים בקלות ולאפשר התמקדות באתרי אינטראקציה ספציפיות. מערכי פפטיד יאפשר זיהוי של אתרי האינטראקציה בין שני חלבונים, כמו גם הקרנה לפפטידים שנקשרים חלבון המטרה למטרות טיפוליות. הם גם מאפשרים מחקרי SAR תפוקה גבוהה. לזיהוי אתרי קישור, typiמערך פפטיד קאל מכיל בדרך כלל חופף חלקית 10-20 פפטידים שאריות נגזרים מהרצפים מלאים של חלבונים אחד מבני זוג או יותר של חלבון המטרה הרצויה. הקרנת המערך לכריכה חלבון המטרה מגלה פפטידים המחייבים, המקביל לאתרי הקישור בחלבונים הדומים, בשיטה קלה ומהירה רק באמצעות כמות קטנה של חלבון.
במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול להקרנת מערכי פפטיד למיפוי אתרי האינטראקציה בין חלבון מטרה ושותפיה. מערך פפטיד נועד מבוסס על הרצפים של חלבוני השותף לוקחים בחשבון מבנים משניים שלהם. מערכי שימוש בפרוטוקול זה היו מערכי Celluspots שהוכנו על ידי מכשירי Bioanalytical INTAVIS. המערך חסום כדי למנוע נוקבים מחייבים ולאחר מכן הודגרו עם החלבון הנחקר. זיהוי באמצעות נוגדן חושף פפטידים מחייבים המתאימים לאתרי אינטראקציה הספציפיים בין החלבונים.
Introduction
אינטראקציות בין חלבונים לתווך את רוב התהליכים בתא החי. אינטראקציות חלבון פגומות עלולות לגרום למחלה, מה שהופך את אינטראקציות חלבון מטרה לתרופות חשובות. מכיוון שכך, חשוב מאוד להבין האינטראקציות הללו ברמה המולקולרית. אינטראקציות חלבון נלמדות תוך שימוש במגוון של טכניקות הנעות בין מבחני סלולריים וביוכימיים למבחנים ביו-פיסיקליים כמותי, ואלה עשויים להתבצע גם עם חלבונים באורך מלא, עם תחומים חלבון או עם פפטידים. פפטידים לשמש כלי מצוין כדי לחקור אינטראקציות חלבון. סיבה לכך הוא פפטידים יכולים להיות מסונתזים בקלות ולאפשר התמקדות באתר אינטראקציה ספציפית מצד אחד, ועל מטרות חלבון מרובות באופן תפוקה גבוהה על יד 1,2 האחר. הקרנת מערך פפטיד היא מהיר, קל לביצוע בשיטה לקבלת כמות גדולה של נתונים על האינטראקציות של חלבון מטרה עם שותפים רבים בזמן קצר 3. שלא כמו שיטות ביוכימיות או ביו-פיסיקליות אחרות לאיתור וניתוח אינטראקציות בין חלבונים, הקרנת מערך פפטיד דורשת ריכוז נמוך מאוד של חלבון והוא יכול לזהות חלש מאוד מחייב. מערכי פפטיד יכולים לשמש ליישומים רבים באינטראקציות פפטיד חלבון כגון מיפוי חלבונים או אתרי האינטראקציה קולטן ליגנד 4, ממשקים שָׁוֶה או הטרו-oligomerization של, נוגדנים המאפיינים epitopes 5, לומדים פעילויות אנזים 6 ותפוקה גבוהה structure- יחסי פעילות (SAR) לומדים 7. לבחינה מעמיקה על הקרנת מערך פפטיד לראות כץ ואח '. 4
מספר סוגים של מערכי פפטיד קיימים כיום. ישנן שתי אסטרטגיות עיקריות סינתטיות להכנת מערכי פפטיד: סינתזה של פפטידים לפני צירופם התמיכה המוצקה, או הסינתזה של פפטידים ישירות על התמיכה המוצקה, בעיקר באמצעות 4,8 טכניקת SPOT.פפטידים מסונתזים על התמיכה המוצקה בדרך כלל על ידי 9-fluorenylmethyloxycarbonyl כימיה (Fmoc) 8. בין התוכניות סינתטיות הנפוצות קובץ מצורף פפטיד דרך התחנה הסופית N (למשל, מערכי pepstar JPT 9) וקובץ מצורף פפטיד דרך התחנה הסופית C הם (למשל, מערכי pepchip PEPSCAN 10, מערכי JPT pepspot 9 ומערכי celluspot INTAVIS 11) 4. התמיכה המוצקה יכולה להשתנות וכך גם הכימיה של צימוד פפטיד אליו. יכולים להיות מחוברים פפטידים הופסקו-Cys שקופיות זכוכית באמצעות קבוצת תיאול 12. התחנה הסופית N של פפטיד יכולה להיות מחויבת קוולנטית לקבוצת הידרוקסיל על הקרום תאית באמצעות esterification של חומצת אמינו מחובר 8.
כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לסינון מערכי פפטיד כשיטה לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון. המערך השתמשנו הוא מערך Celluspots, שהוא מיקרו-מערך המכיל amo הגדולUNT של כתמים (כפילויות של עד 384 נקודות) על קרום תאית קטן הנתמכים על ידי שקופית זכוכית. זה מאפשר עבודה עם כמויות נמוכות של חלבון ונוגדנים וקבלת כמות משמעותית של נתונים לכל ניסוי בודד. מערך זה מכיל גם צפיפות פפטיד גבוהה המאפשרת זיהוי של זיקה נמוכה מחייבת. המערך שימש למיפוי האינטראקציה Stil-CHFR, וזה חשוב מאוד לשליטה בתא נורמלי התפשטות 13. אינטראקציה בלתי מבוקרת בין שני החלבונים יכולה להוביל להתפתחות הסרטן. על ידי מיפוי אינטראקציה זו שמצאנו את אתר הקישור הספציפי ומחייבים שאריות 14. זו סוללת את הדרך לעיצוב מעכבים רציונאליים המעכבים אינטראקציה חלבון-חלבון זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הקרנת מערך פפטיד היא כלי מצוין לזיהוי אתרי הקישור של חלבון מטרה בשותפיה. assay זה הוא מהיר וקל לביצוע וניתן לקבל תוצאות באחד או שני ימי עבודה. הקרנת מערך פפטיד היא תכליתית ויכולה לשמש למטרות רבות. ניתן להשתמש בו לאפיון שינויי תרגום פוסט כגון זרחון וזיהוי מצעים של קינאזו?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AF נתמכה על ידי מענק החל ממועצת המחקר האירופית תחת שביעי תכנית המסגרת של הקהילה האירופית (FP7 / 2007-2013) / הסכם ERC גרנט N ° 203,413 ועל ידי מרכז מינרבה לביו-היברידי systems.HA המורכב וAI נתמך על ידי דליה ודן מידן המלגה לסטודנטים לתואר מתקדם באוניברסיטת עברית בירושלים.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| His-probe Antibody (H-3) HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-8036 HRP | |
| EZ-ECL Kit | Biological industries | 20-500-120 | |
| Skim Milk | Becton, Dickinson and Company | 232100 | |
| LAS-3000 camera | FUJI film |
References
- Benyamini, H., Friedler, A. Using peptides to study protein–protein interactions. Future Medicinal Chemistry. 2 (6), 989-1003 (2010).
- Geysen, H. M., Wagner, C. D. Isotope or mass encoding of combinatorial libraries. Chemistry & Biology. 3 (8), 679-688 (1996).
- Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
- Katz, C., Levy-Beladev, L., Rotem-Bamberger, S., Rito, T., Rudiger, S. G., Friedler, A. Studying protein-protein interactions using peptide arrays. Chem Soc Rev. 40 (5), 2131-2145 (2011).
- Hansen, L. B., Buus, S., Schafer-Nielsen, C. Identification and Mapping of Linear Antibody Epitopes in Human Serum Albumin Using High-Density Peptide Arrays. PLoS ONE. 8 (7), (2013).
- Uecker, A. A substrate peptide for the FLT3 receptor tyrosine kinase. British Journal of Haematology. 144 (1), 127-130 (2009).
- Gabizon, R., Faust, O., Benyamini, H., Nir, S., Loyter, A., Friedler, A. Structure-activity relationship studies using peptide arrays: the example of HIV-1 Rev-integrase interaction. Med. Chem. Commun. 4 (1), 252-259 (2013).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique: Synthetic peptide arrays on membrane supports—principles and applications. Journal of Immunological Methods. 267 (1), 13-26 (2002).
- Falsey, J. R., Renil, M., Park, S., Li, S., Lam, K. S. Peptide and Small Molecule Microarray for High Throughput Cell Adhesion and Functional Assays. Bioconjugate Chemistry. 12 (3), 346-353 (2001).
- Castiel, A., Danieli, M. M. The Stil protein regulates centrosome integrity and mitosis through suppression of Chfr. Journal of Cell Science. 124 (4), 532-539 (2011).
- Amartely, H., David, A., Lebendiker, M., Benyamini, H., Izraeli, S., Friedler, A. The STIL protein contains intrinsically disordered regions that mediate its protein-protein interactions. Chemical Communications. 50, 5245-5247 (2013).
- Izraeli, S., Lowe, L. A. The SIL gene is required for mouse embryonic axial development and left-right specification. Nature. 399 (6737), 691-694 (1999).
- Izraeli, S., Colaizzo-Anas, T., Bertness, V. L., Mani, K., Aplan, P. D., Kirsch, I. R. Expression of the SIL gene is correlated with growth induction and cellular proliferation. Cell Growth Differ. 8 (11), 1171-1179 (1997).
- Arquint, C., Sonnen, K. F., Stierhof, Y. -. D., Nigg, E. a Cell-cycle-regulated expression of STIL controls centriole number in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1342-1352 (2012).
- Tang, C. J., Lin, S. Y. The human microcephaly protein STIL interacts with CPAP and is required for procentriole formation. Embo J. 30 (23), 4790-4804 (2011).
- Vulprecht, J., David, A. STIL is required for centriole duplication in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1353-1362 (2012).
- Campaner, S., Kaldis, P., Izraeli, S., Kirsch, I. R. Sil phosphorylation in a Pin1 binding domain affects the duration of the spindle checkpoint. Mol Cell Biol. 25 (15), 6660-6672 (2005).
- Kasai, K., Inaguma, S., Yoneyama, A., Yoshikawa, K., Ikeda, H. SCL/TAL1 interrupting locus derepresses GLI1 from the negative control of suppressor-of-fused in pancreatic cancer cell. Cancer Res. 68 (19), 7723-7729 (2008).
- Chaturvedi, P., Sudakin, V. Chfr regulates a mitotic stress pathway through its RING-finger domain with ubiquitin ligase activity. Cancer Res. 62 (6), 1797-1801 (2002).
- Olaussen, K. a., Commo, F. Synergistic proapoptotic effects of the two tyrosine kinase inhibitors pazopanib and lapatinib on multiple carcinoma cell lines. Oncogene. 28 (48), 4249-4260 (2009).
- Reingewertz, T. H., Britan-Rosich, E. Mapping the Vif–A3G interaction using peptide arrays: A basis for anti-HIV lead peptides. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (12), 3523-3532 (2013).
- Katz, C., Benyamini, H. Molecular basis of the interaction between the antiapoptotic Bcl-2 family proteins and the proapoptotic protein ASPP2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12277-12282 (2008).
- Katz, C., Zaltsman-Amir, Y., Mostizky, Y., Kollet, N., Gross, A., Friedler, A. Molecular Basis of the Interaction between Proapoptotic Truncated BID (tBID) Protein and Mitochondrial Carrier Homologue 2 (MTCH2) Protein: KEY PLAYERS IN MITOCHONDRIAL DEATH PATHWAY. Journal of Biological Chemistry. 287 (18), 15016-15023 (2012).
- Rosenberg, M. M., Ronen, D., Lahav, N., Nazirov, E., Ravid, S., Friedler, A. High resolution characterization of myosin IIC tailpiece and its effect on filament assembly. Journal of Biological Chemistry. 288 (14), 9779-9789 (2013).
