Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi
Summary
Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.
Abstract
Protein-protein etkileşimleri, organizmanın canlı hücresi ve kontrol homeostazında işlemlerinin çoğunun aracılık eder. Engelliler protein etkileşimleri protein etkileşimlerini önemli ilaç hedeflerini, yapım hastalığına neden olabilir. Bu, moleküler seviyede, bu etkileşimleri anlamak için bu nedenle çok önemlidir. Protein etkileşimleri, hücresel ve biyokimyasal tahlilleri kantitatif biyofiziksel deneylerinde değişen çeşitli teknikler kullanılarak incelenmiştir ve bu protein alanları ile ya da peptidler ile, tam uzunlukta proteinler ile gerçekleştirilebilir. Peptitler peptitler kolaylıkla sentez edilebilir çünkü protein etkileşimleri çalışma ve belirli etkileşim siteleri odaklanarak izin olarak mükemmel araçlar hizmet vermektedir. Peptid dizileri tedavi amacıyla hedef proteini bağlanan peptidleri, iki protein arasındaki etkileşim bölgeleri tespitine olarak elenmesini sağlamak. Onlar da yüksek kapasiteli SAR çalışmaları sağlar. Bağlanma yerleri, bir tipik ola tanımlanması içinCal peptid dizisi genellikle, kısmen istenilen hedef proteinin bir veya daha fazla ortak proteinlerin tam dizilerinden türetilen 10-20 kalıntıları çakışan peptidler içerir. Hedef bağlama proteini için bir dizi tarama proteinin sadece az miktarda kullanarak kolay ve hızlı bir yöntem ortak proteinlerin bağlanma bölgeleri, karşılık gelen bağlanan peptitleri göstermektedir.
Bu yazıda, bir hedef protein ve ortakları arasındaki etkileşim siteleri haritalanması için peptid dizileri taranması için bir protokol açıklar. Peptid dizisi hesaba kendi ikincil yapılar alan ortak proteinlerin dizileri temel alınarak tasarlanmıştır. Bu protokolde kullanılan diziler INTAVIS Biyoanalitik Instruments tarafından hazırlanan Celluspots diziler vardı. Dizi özgül olmayan bağlanma ve üzerinde çalışılan protein ile kuluçkaya önlemek için bloke edilir. Bir antikor kullanılarak saptanması, proteinler arasındaki özel etkileşim sahalarına karşılık gelen bağlanan peptitleri göstermektedir.
Introduction
Protein-protein etkileşimleri canlı hücrenin içinde işlemlerinin çoğunun aracılık eder. Engelliler protein etkileşimleri protein etkileşimlerini önemli ilaç hedeflerini, yapım hastalığına neden olabilir. Bu, moleküler seviyede, bu etkileşimleri anlamak için bu nedenle çok önemlidir. Protein etkileşimleri, hücresel ve biyokimyasal tahlilleri kantitatif biyofiziksel deneylerinde değişen çeşitli teknikler kullanılarak incelenmiştir ve bu protein alanları ile ya da peptidler ile, tam uzunlukta proteinler ile gerçekleştirilebilir. Peptidler protein etkileşimleri çalışmak için mükemmel araçlar hizmet vermektedir. Peptidler kolayca sentezlenebilen ve bir taraftan ve diğer taraftan 1,2 üzerinde yüksek verimli bir şekilde birden fazla protein hedefleri üzerinde belirli bir etkileşim sitesi odaklanarak izin edilebilir olmasıdır. Peptid dizisi tarama bir hızlı, kısa bir süre 3 çok sayıda ortakları ile bir hedef protein etkileşimleri ile ilgili verilerin büyük miktarda elde edilmesi için bir metodu gerçekleştirmek için kullanımı kolay. Protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve analiz etmek için diğer biyokimyasal ve biyofiziksel yöntemlerden farklı olarak, peptid dizi tarama protein çok düşük bir konsantrasyonu gerektirir ve nihai çok zayıf algılayabilir. Peptid dizileri enzim aktivitelerini 6 ve yüksek verim inceleyerek, protein-protein ya da reseptör-ligand etkileşim bölgeleri 4, homo veya hetero-oligomerizasyon arayüzleri eşleme gibi peptid-protein etkileşimleri birçok uygulama için karakterize edici antikorlar 5 epitoplar kullanılabilir Yapısal aktivite ilişkisi (SAR) 7 inceler. Peptit dizisi tarama hakkında derinlemesine bir inceleme için Katz ve arkadaşları bkz. 4
Peptid dizilerin çeşitli tipleri şu anda mevcuttur. Peptidlerin sentezi esas olarak spot tekniği 4,8 kullanarak, doğrudan katı destek üzerindeki peptit, katı destek veya sentezine tutturulmadan önce: peptid dizilerini hazırlamak için, iki büyük sentetik stratejiler vardır.peptidler, 9-florenilmetiloksikarbonil (FMOC) 8, genellikle katı bir destek üzerinde sentezlenir. Yaygın sentetik şemalarda arasında Cı ucu yoluyla peptid N ucu yoluyla bağlantı (ör JPT pepstar dizileri 9) ve peptit bağlanma (örneğin, PepScan pepchip dizileri 10, JPT pepspot diziler 9 ve INTAVIS celluspot dizileri 11) 4. Katı destek değişir ve böylece kendisine peptit bağlama kimyasını neden olmamaktadır. Cys-sonlu peptidler tiol grubu 12 ile cam slaytlar bağlı olabilir. Bir peptidin N sonu bir birlik oluşturacak amino asidin esterifikasyonu yoluyla selüloz zar üzerinde bir hidroksil grubuna bağlı olabilir 8 eklenmiş.
Burada, protein-protein etkileşimlerini incelemek için olan bir yöntem olarak peptid dizileri taranması için ayrıntılı bir protokol sunmaktır. Biz kullanılan dizi büyük amo içeren bir mikro-dizi Celluspots dizidirBir cam slayt tarafından desteklenen küçük bir selüloz zarı üzerine noktalar (384 noktalar çiftleri) ve unt. Bu düşük protein hacmi ve antikorlar ile çalışan ve tek bir deneyde başına veri önemli miktarda elde edilmesini mümkün kılmaktadır. Bu dizi aynı zamanda düşük bağlanma afinite algılanmasını sağlayan yüksek peptid yoğunluğu içerir. Dizi, normal hücre çoğalması 13 kontrol etmek için son derece önemli olan Stil-CHFR etkileşim haritalama için kullanılmıştır. İki protein arasındaki Kontrolsüz etkileşim kanser gelişimine yol açabilir. Bu etkileşimi haritalama biz spesifik bağlanma yeri ve artıklarını 14 bağlayıcı bulundu. Bu, protein-protein etkileşimini inhibe rasyonel inhibitörleri tasarımı için önünü açıyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Peptid dizisi tarama ortaklarının bir hedef proteinin bağlanma mevkilerinin belirlenmesi için mükemmel bir araçtır. Bu testin gerçekleştirilmesi için, hızlı ve kolay ve sonuçlar, bir veya iki gün içinde elde edilebilir. Peptid dizisi tarama çok yönlüdür ve birçok amaç için kullanılabilir. Bu fosforilasyon gibi post çeviri modifikasyonlar tanımlanması ve kinazların alt tabakaların tanımlanması için de kullanılabilir. Örneğin: miyeloid lösemi, akut ilgilidir FLT3 kinaz, bir peptit dizisi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AF Avrupa Topluluğu Yedinci Çerçeve Programı kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi bir başlangıç hibe ile desteklenmiştir (FP7 / 2007-2013) / ERC Hibe sözleşmesi n 203.413 ° ve karmaşık systems.HA Bio-hibrid ve AI için Minerva Merkezi tarafından desteklenen Kudüs İbrani Üniversitesi'nde ileri derecesi olan öğrenciler için Dalia ve Dan Maydan Kardeşliği tarafından.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| His-probe Antibody (H-3) HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-8036 HRP | |
| EZ-ECL Kit | Biological industries | 20-500-120 | |
| Skim Milk | Becton, Dickinson and Company | 232100 | |
| LAS-3000 camera | FUJI film |
References
- Benyamini, H., Friedler, A. Using peptides to study protein–protein interactions. Future Medicinal Chemistry. 2 (6), 989-1003 (2010).
- Geysen, H. M., Wagner, C. D. Isotope or mass encoding of combinatorial libraries. Chemistry & Biology. 3 (8), 679-688 (1996).
- Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
- Katz, C., Levy-Beladev, L., Rotem-Bamberger, S., Rito, T., Rudiger, S. G., Friedler, A. Studying protein-protein interactions using peptide arrays. Chem Soc Rev. 40 (5), 2131-2145 (2011).
- Hansen, L. B., Buus, S., Schafer-Nielsen, C. Identification and Mapping of Linear Antibody Epitopes in Human Serum Albumin Using High-Density Peptide Arrays. PLoS ONE. 8 (7), (2013).
- Uecker, A. A substrate peptide for the FLT3 receptor tyrosine kinase. British Journal of Haematology. 144 (1), 127-130 (2009).
- Gabizon, R., Faust, O., Benyamini, H., Nir, S., Loyter, A., Friedler, A. Structure-activity relationship studies using peptide arrays: the example of HIV-1 Rev-integrase interaction. Med. Chem. Commun. 4 (1), 252-259 (2013).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique: Synthetic peptide arrays on membrane supports—principles and applications. Journal of Immunological Methods. 267 (1), 13-26 (2002).
- Falsey, J. R., Renil, M., Park, S., Li, S., Lam, K. S. Peptide and Small Molecule Microarray for High Throughput Cell Adhesion and Functional Assays. Bioconjugate Chemistry. 12 (3), 346-353 (2001).
- Castiel, A., Danieli, M. M. The Stil protein regulates centrosome integrity and mitosis through suppression of Chfr. Journal of Cell Science. 124 (4), 532-539 (2011).
- Amartely, H., David, A., Lebendiker, M., Benyamini, H., Izraeli, S., Friedler, A. The STIL protein contains intrinsically disordered regions that mediate its protein-protein interactions. Chemical Communications. 50, 5245-5247 (2013).
- Izraeli, S., Lowe, L. A. The SIL gene is required for mouse embryonic axial development and left-right specification. Nature. 399 (6737), 691-694 (1999).
- Izraeli, S., Colaizzo-Anas, T., Bertness, V. L., Mani, K., Aplan, P. D., Kirsch, I. R. Expression of the SIL gene is correlated with growth induction and cellular proliferation. Cell Growth Differ. 8 (11), 1171-1179 (1997).
- Arquint, C., Sonnen, K. F., Stierhof, Y. -. D., Nigg, E. a Cell-cycle-regulated expression of STIL controls centriole number in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1342-1352 (2012).
- Tang, C. J., Lin, S. Y. The human microcephaly protein STIL interacts with CPAP and is required for procentriole formation. Embo J. 30 (23), 4790-4804 (2011).
- Vulprecht, J., David, A. STIL is required for centriole duplication in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1353-1362 (2012).
- Campaner, S., Kaldis, P., Izraeli, S., Kirsch, I. R. Sil phosphorylation in a Pin1 binding domain affects the duration of the spindle checkpoint. Mol Cell Biol. 25 (15), 6660-6672 (2005).
- Kasai, K., Inaguma, S., Yoneyama, A., Yoshikawa, K., Ikeda, H. SCL/TAL1 interrupting locus derepresses GLI1 from the negative control of suppressor-of-fused in pancreatic cancer cell. Cancer Res. 68 (19), 7723-7729 (2008).
- Chaturvedi, P., Sudakin, V. Chfr regulates a mitotic stress pathway through its RING-finger domain with ubiquitin ligase activity. Cancer Res. 62 (6), 1797-1801 (2002).
- Olaussen, K. a., Commo, F. Synergistic proapoptotic effects of the two tyrosine kinase inhibitors pazopanib and lapatinib on multiple carcinoma cell lines. Oncogene. 28 (48), 4249-4260 (2009).
- Reingewertz, T. H., Britan-Rosich, E. Mapping the Vif–A3G interaction using peptide arrays: A basis for anti-HIV lead peptides. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (12), 3523-3532 (2013).
- Katz, C., Benyamini, H. Molecular basis of the interaction between the antiapoptotic Bcl-2 family proteins and the proapoptotic protein ASPP2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12277-12282 (2008).
- Katz, C., Zaltsman-Amir, Y., Mostizky, Y., Kollet, N., Gross, A., Friedler, A. Molecular Basis of the Interaction between Proapoptotic Truncated BID (tBID) Protein and Mitochondrial Carrier Homologue 2 (MTCH2) Protein: KEY PLAYERS IN MITOCHONDRIAL DEATH PATHWAY. Journal of Biological Chemistry. 287 (18), 15016-15023 (2012).
- Rosenberg, M. M., Ronen, D., Lahav, N., Nazirov, E., Ravid, S., Friedler, A. High resolution characterization of myosin IIC tailpiece and its effect on filament assembly. Journal of Biological Chemistry. 288 (14), 9779-9789 (2013).
