Identifiera protein-proteininteraktion webbplatser Använda peptid Arrays
Summary
Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.
Abstract
Protein-proteininteraktioner förmedlar de flesta processer i levande celler och kontroll homeostas av organismen. Osäkra proteininteraktioner kan leda till sjukdom, vilket gör proteininteraktioner viktiga målproteiner. Det är därför mycket viktigt att förstå dessa interaktioner på molekylär nivå. Protein interaktioner studeras med hjälp av olika tekniker, från cellulära och biokemiska analyser av kvantitativa biofysiska analyser, och dessa kan utföras antingen med fullängdsproteiner, med proteindomäner eller med peptider. Peptider fungerar som utmärkta verktyg för att studera proteininteraktioner eftersom peptider lätt kan syntetiseras och låta fokus på specifika interaktionsplatser. Peptid arrayer möjliggör identifiering av interaktionsställen mellan två proteiner samt screening för peptider som binder målproteinet i terapeutiskt syfte. De gör det också hög kapacitet SAR studier. För identifiering av bindningsställen, en typical peptiduppställningen innehåller vanligtvis delvis överlappande 10 till 20 rester peptider härledda från de fullständiga sekvenserna för ett eller flera partnerproteiner av den önskade målproteinet. Screening arrayen för bindning målproteinet avslöjar bindande peptider, som motsvarar bindningsställena i partnerproteiner, i en enkel och snabb metod med användning av endast små mängder av protein.
I den här artikeln beskriver vi ett protokoll för screening peptid arrayer för att kartlägga interaktionsställen mellan ett målprotein och dess partners. Peptiduppställningen är utformad baserat på sekvenserna för de partnerproteiner med beaktande av deras sekundära strukturer. De arrayer används i detta protokoll var Celluspots matriser utarbetats av INTAVIS Bioanalytiska Instruments. Matrisen är blockerad för att förhindra ospecifik bindning och inkuberades därefter med det studerade proteinet. Detektering med användning av en antikropp avslöjar bindande peptider som motsvarar de specifika interaktionsställen mellan proteinerna.
Introduction
Protein-proteininteraktioner förmedlar de flesta av de processer i den levande cellen. Osäkra proteininteraktioner kan leda till sjukdom, vilket gör proteininteraktioner viktiga målproteiner. Det är därför mycket viktigt att förstå dessa interaktioner på molekylär nivå. Protein interaktioner studeras med hjälp av olika tekniker, från cellulära och biokemiska analyser av kvantitativa biofysiska analyser, och dessa kan utföras antingen med fullängdsproteiner, med proteindomäner eller med peptider. Peptider fungerar som utmärkta verktyg för att studera proteininteraktioner. Detta beror på att peptider kan lätt syntetiseras och tillåta den att fokusera på en specifik interaktionsstället på ena sidan och på flera proteinmål i en hög genomströmning sätt å andra sidan 1,2. Peptid array screening är en snabb, enkel att utföra metoden för att erhålla en stor mängd data om samspelet mellan ett målprotein med många partners på kort tid 3. Till skillnad från andra biokemiska eller biofysikaliska förfaranden för detektion och analys av protein-proteininteraktioner, kräver peptiduppställningen screening en mycket låg koncentration av protein och kan detektera mycket svag bindning. Peptid matriser kan användas för många tillämpningar inom peptid-protein-interaktioner, såsom kartläggning av protein-protein eller receptor-ligand interaktionsställen 4, homo- eller hetero-oligomerisering gränssnitten, kännetecknande antikroppar epitoper 5, studerade enzymaktiviteter 6 och hög genomströmning struktur- aktivitetssamband (SAR) studerar 7. För en fördjupad översyn om peptid array screening se Katz et al. 4
Flera typer av peptid arrayer existerar idag. Det finns två stora syntetiska strategier för att göra peptid arrayer: syntes av peptiderna innan de kopplas till det fasta underlaget, eller syntes av peptider direkt på det fasta underlaget, främst med hjälp av SPOT-teknik 4,8. DenPeptiderna syntetiseras på den fasta bäraren vanligtvis med 9-fluorenylmetyloxikarbonyl (Fmoc) -kemi 8. Bland de gemensamma syntesscheman är peptid fastsättning med N-terminalen (t.ex. JPT Pepstar arrayer 9) och peptid fastsättning med C-terminalen (t.ex. PEPSCAN pepchip arrayer 10, JPT pepspot arrayer 9 och INTAVIS celluspot arrayer 11) 4. Den fasta bäraren kan variera och så gör kemin i peptidkoppling till den. Cys-terminerade peptider kan bindas till objektglas via tiolgruppen 12. N-terminalen av en peptid kan vara kovalent bunden till en hydroxylgrupp på cellulosamembran genom förestring av aminosyran fäst 8.
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för screening av peptiduppsättningar som en metod för att studera protein-proteininteraktioner. Arrayen vi använde är Celluspots array, som är en mikro-array som innehåller stor amount av fläckar (dubbletter på upp till 384 punkter) på en liten cellulosamembran som stöds av en glasskiva. Detta gör det möjligt att arbeta med låga volymer av protein och antikroppar och få betydande mängd data per enda experiment. Denna samling innehåller också hög peptiddensitet som möjliggör detektion av låg affinitetsbindning. Matrisen användes för att kartlägga den STIL-CHFR växelverkan, som är mycket viktig för att reglera normal cellproliferation 13. Okontrollerad interaktion mellan de två proteinerna kan leda till utveckling av cancer. Genom att kartlägga denna interaktion fann vi det specifika bindningsstället och bindande resterna 14. Detta banar väg för att utforma rationella hämmare som hämmar detta protein-proteininteraktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Peptid array screening är ett utmärkt verktyg för att identifiera bindningsställena för ett målprotein i sina partners. Denna analys är snabb och enkel att utföra och resultatet kan uppnås i en eller två arbetsdagar. Peptid array screening är mångsidiga och kan användas för många ändamål. Den kan användas för att karakterisera post modifieringar översättnings såsom fosforylering och identifiera substrat av kinaser. Till exempel: FLT3-kinas, som är relaterad till akut myeloisk leukemi, fosforylerar…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AF fick stöd av ett startbidrag från det europeiska forskningsrådet inom ramen för Europeiska gemenskapens sjunde ramprogram (FP7 / 2007-2013) / ERC Grant överenskommelse n ° 203413 och av Minerva Centrum för Bio-hybrid komplex systems.HA och AI stöds av Dalia och Dan Maydan Fellowship för avancerade examensstuderande vid Hebreiska universitetet i Jerusalem.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| His-probe Antibody (H-3) HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-8036 HRP | |
| EZ-ECL Kit | Biological industries | 20-500-120 | |
| Skim Milk | Becton, Dickinson and Company | 232100 | |
| LAS-3000 camera | FUJI film |
References
- Benyamini, H., Friedler, A. Using peptides to study protein–protein interactions. Future Medicinal Chemistry. 2 (6), 989-1003 (2010).
- Geysen, H. M., Wagner, C. D. Isotope or mass encoding of combinatorial libraries. Chemistry & Biology. 3 (8), 679-688 (1996).
- Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
- Katz, C., Levy-Beladev, L., Rotem-Bamberger, S., Rito, T., Rudiger, S. G., Friedler, A. Studying protein-protein interactions using peptide arrays. Chem Soc Rev. 40 (5), 2131-2145 (2011).
- Hansen, L. B., Buus, S., Schafer-Nielsen, C. Identification and Mapping of Linear Antibody Epitopes in Human Serum Albumin Using High-Density Peptide Arrays. PLoS ONE. 8 (7), (2013).
- Uecker, A. A substrate peptide for the FLT3 receptor tyrosine kinase. British Journal of Haematology. 144 (1), 127-130 (2009).
- Gabizon, R., Faust, O., Benyamini, H., Nir, S., Loyter, A., Friedler, A. Structure-activity relationship studies using peptide arrays: the example of HIV-1 Rev-integrase interaction. Med. Chem. Commun. 4 (1), 252-259 (2013).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique: Synthetic peptide arrays on membrane supports—principles and applications. Journal of Immunological Methods. 267 (1), 13-26 (2002).
- Falsey, J. R., Renil, M., Park, S., Li, S., Lam, K. S. Peptide and Small Molecule Microarray for High Throughput Cell Adhesion and Functional Assays. Bioconjugate Chemistry. 12 (3), 346-353 (2001).
- Castiel, A., Danieli, M. M. The Stil protein regulates centrosome integrity and mitosis through suppression of Chfr. Journal of Cell Science. 124 (4), 532-539 (2011).
- Amartely, H., David, A., Lebendiker, M., Benyamini, H., Izraeli, S., Friedler, A. The STIL protein contains intrinsically disordered regions that mediate its protein-protein interactions. Chemical Communications. 50, 5245-5247 (2013).
- Izraeli, S., Lowe, L. A. The SIL gene is required for mouse embryonic axial development and left-right specification. Nature. 399 (6737), 691-694 (1999).
- Izraeli, S., Colaizzo-Anas, T., Bertness, V. L., Mani, K., Aplan, P. D., Kirsch, I. R. Expression of the SIL gene is correlated with growth induction and cellular proliferation. Cell Growth Differ. 8 (11), 1171-1179 (1997).
- Arquint, C., Sonnen, K. F., Stierhof, Y. -. D., Nigg, E. a Cell-cycle-regulated expression of STIL controls centriole number in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1342-1352 (2012).
- Tang, C. J., Lin, S. Y. The human microcephaly protein STIL interacts with CPAP and is required for procentriole formation. Embo J. 30 (23), 4790-4804 (2011).
- Vulprecht, J., David, A. STIL is required for centriole duplication in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1353-1362 (2012).
- Campaner, S., Kaldis, P., Izraeli, S., Kirsch, I. R. Sil phosphorylation in a Pin1 binding domain affects the duration of the spindle checkpoint. Mol Cell Biol. 25 (15), 6660-6672 (2005).
- Kasai, K., Inaguma, S., Yoneyama, A., Yoshikawa, K., Ikeda, H. SCL/TAL1 interrupting locus derepresses GLI1 from the negative control of suppressor-of-fused in pancreatic cancer cell. Cancer Res. 68 (19), 7723-7729 (2008).
- Chaturvedi, P., Sudakin, V. Chfr regulates a mitotic stress pathway through its RING-finger domain with ubiquitin ligase activity. Cancer Res. 62 (6), 1797-1801 (2002).
- Olaussen, K. a., Commo, F. Synergistic proapoptotic effects of the two tyrosine kinase inhibitors pazopanib and lapatinib on multiple carcinoma cell lines. Oncogene. 28 (48), 4249-4260 (2009).
- Reingewertz, T. H., Britan-Rosich, E. Mapping the Vif–A3G interaction using peptide arrays: A basis for anti-HIV lead peptides. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (12), 3523-3532 (2013).
- Katz, C., Benyamini, H. Molecular basis of the interaction between the antiapoptotic Bcl-2 family proteins and the proapoptotic protein ASPP2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12277-12282 (2008).
- Katz, C., Zaltsman-Amir, Y., Mostizky, Y., Kollet, N., Gross, A., Friedler, A. Molecular Basis of the Interaction between Proapoptotic Truncated BID (tBID) Protein and Mitochondrial Carrier Homologue 2 (MTCH2) Protein: KEY PLAYERS IN MITOCHONDRIAL DEATH PATHWAY. Journal of Biological Chemistry. 287 (18), 15016-15023 (2012).
- Rosenberg, M. M., Ronen, D., Lahav, N., Nazirov, E., Ravid, S., Friedler, A. High resolution characterization of myosin IIC tailpiece and its effect on filament assembly. Journal of Biological Chemistry. 288 (14), 9779-9789 (2013).
