Détection de In Situ complexes protéine-protéine à la Drosophila Larvaire jonction neuromusculaire Utilisation Proximité ligature Assay

Résumé

Ce protocole montre comment Proximité Ligation Assay peut être utilisé pour détecter des interactions protéine-protéine in situ à la jonction des larves de Drosophila neuromusculaire. Avec cette technique, disques grande et Hu-li shao de tai sont présentés pour former un complexe dans la région post-synaptique, une association préalablement identifiés par co-immunoprécipitation.

Résumé

Discs large (Dlg) est un membre conservé de la famille des guanylate kinases associées à la membrane, et sert de protéine d’échafaudage majeure à la jonction neuromusculaire larvaire (NMJ) chez la drosophile. Des études antérieures ont montré que la distribution postsynaptique de Dlg au niveau de la NMJ larvaire chevauche celle de Hu-li tai shao (Hts), un homologue des adducines de mammifères. De plus, on observe que Dlg et Hts forment un complexe l’un avec l’autre sur la base d’expériences de co-immunoprécipitation impliquant des lysats de mouches adultes entières. Cependant, en raison de la nature de ces expériences, on ne savait pas si ce complexe existait spécifiquement au NMJ pendant le développement larvaire.

Le test de ligature de proximité (PLA) est une technique récemment développée utilisée principalement dans la culture cellulaire et tissulaire qui permet de détecter les interactions protéine-protéine in situ. Dans ce test, les échantillons sont incubés avec des anticorps primaires contre les deux protéines d’intérêt à l’aide de procédures immunohistochimiques standard. Les anticorps primaires sont ensuite détectés à l’aide d’une paire spécialement conçue d’anticorps secondaires conjugués à des oligonucléotides, appelés sondes PLA, qui ne peuvent être utilisées pour générer un signal que lorsque les deux sondes se sont liées à proximité l’une de l’autre. Ainsi, les protéines qui se trouvent dans un complexe peuvent être visualisées. Ici, il est démontré comment le PLA peut être utilisé pour détecter in situ les interactions protéine-protéine au niveau de la NMJ larvaire de la drosophile. La technique est réalisée sur des préparations musculaires de la paroi corporelle larvaire pour montrer qu’il existe effectivement un complexe entre Dlg et Hts dans la région postsynaptique des NMJ.

Introduction

Drosophila disques large (DLG) est un élément conservé de la famille guanylate kinase associée à la membrane d'un échafaudage de protéines qui aident à orchestrer l'ensemble de grands complexes de protéines à des sites spécifiques de la membrane plasmique. Initialement identifié comme une protéine suppresseur de tumeur, Dlg sert un déterminant important de l'épithélium ^1,2,3 apicobasal de polarité. Dlg sert également un module d'échafaudage majeur à la jonction neuromusculaire (JNM) des neurones moteurs glutamatergiques cours du développement larvaire ^4. Dlg joue divers rôles à la JNM des larves, et son pléiotropisme rep....

Protocole

1. Préparation du corps mur

REMARQUE: Préparation du troisième stade larvaire parois du corps (par étude des NMJs qui innervent les muscles de la paroi du corps) a été réalisée comme décrit précédemment dans Brent et al ^dix, ou Ramachandran et Budnik ^11,12, mais avec quelques modifications..

1. Dissection
   1. Augmenter les stocks et les croix mouche à 25 ° C pendant cinq à six jours en utilisant des procédures standard ^13.
   2. Choisissez ramper troisième stade larvaire de flacons ou bouteilles en utilisant une pince fine.
   3. Laver les larves dans une petite boîte....

Résultats

Dans de type sauvage troisième stade larvaire NMJs, Dlg est principalement trouvé à la membrane postsynaptique de type I boutons glutamatergiques, avec des niveaux d'immunoréactivité Dlg étant plus marquée dans le type Ib boutons que le type est boutons (figure 3A) ^4. Hts est présent tout au long du muscle, mais se concentre dans la région post-synaptique avec Hts niveaux d'immunoréactivité apparaissant égale dans les deux boutons de type I, et se retrouve également présynaptique (fig.......

Discussion

Ce rapport montre comment PLA peut être appliqué à la drosophile larves NMJ. Le dosage est réalisé sur des larves préparations de muscle de la paroi du corps dans le but de détecter les interactions protéine-protéine endogènes présentes à la jonction neuromusculaire. Avec cette technique, Dlg Hts et sont indiqués pour être à proximité immédiate de l'autre, et ainsi exister dans un complexe, en particulier dans la région post-synaptique ^27. À l'appui de ce résultat, une étude précédente a four.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pince (fine #5)	Almedic	A10-704
Sylgard Disc	World Precision Instruments	SYLG184	Mélanger la base d’élastomère et l’agent de durcissement dans un rapport de 10:1. Laisser reposer pendant 30 min. Verser dans un moule ( par exemple utiliser une plaque de culture cellulaire à 12 puits). Laisser durcir pendant au moins 24 heures. Collez le couvercle d’une boîte de Pétri de 60 x 15 mm lors de la dissection.
Pin’s Minutien (0.0125  ; mm diamètre de la pointe)	Fine Science Tools	26002-10
Microdissection Ciseaux (ultra fins)	Fine Science Tools	15200-00
Lames de			Collez deux lamelles de 22 x 22 mm 2 sur une lame de microscope avec du vernis à ongles transparent, en laissant un < Espace de 20 mm entre les deux pour le montage de l’échantillon.
w1118	Bloomington Drosophila Stock Center	3605
hts01103	Bloomington Drosophila Stock Center	10989	stock a été rééquilibré sur un équilibreur GFP afin que les mutants homozygotes puissent être sélectionnés en fonction de l’absence de signal GFP.
1x PBS (solution saline tamponnée au phosphate) : 3  ; mM NaH2PO4, 7  ; mM Na2HPO4, 130  ; mM NaCl, pH 7,0			NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Solution de Bouin	Sigma-Aldrich	HT10132 4 %
PFA (paraformaldéhyde) : 4 % PFA dans 1x PBS			PFA (Anachemia Science - 66194-300). Voir doi :10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 pour des instructions sur la façon de préparer la solution.
[en-tête]
1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton) : 1x PBS avec 0,01 % de Triton			Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)
1 % BSA (Bovine Serum Albumin) : 1 % BSA dans 1x PBT			BSA (Bioshop Canada - ALB001). Conserver à 4 °C.
souris anti-Dlg (Disques grands)	Etudes développementales Hybridoma Bank	4F3	Utilisation à une dilution de 1:10 dans 1 % BSA.
lapin anti-HtsM (Hu-li tai shao)			Fourni par le Dr Lynn Cooley (Université de Yale). Utiliser à une dilution de 1:250 dans 1 % BSA.
anti-Pak de lapin (kinase activée par p21)			Fourni par le Dr Nicholas Harden (Université Simon Fraser). Utiliser à une dilution de 1:500 dans 1 % BSA.
souris anti-Wg (sans ailes)	Etudes développementales Hybridoma Bank	4D4	Utilisation à une dilution de 1:5 dans 1 % BSA.
chèvre anti-Hrp (Raifort peroxydase)	Jackson  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; ImmunoResearch	123-065-021	Utilisation à une dilution de 1:200 dans 1 % BSA.
Âne conjugué FITC anti-chèvre	Jackson  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; ImmunoResearch	705-095-003	Utilisation à une dilution de 1:200 dans 1 % de BSA.
Sonde PLA in situ Duolink anti-souris MOINS	Sigma-Aldrich	DUO92004
Sonde PLA in situ Duolink anti-lapin PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002
Réactifs de détection in situ Duolink Red	Sigma-Aldrich	DUO92008
1x tampon de lavage A : 0,01 M Tris, 0,15  ; M NaCl, 0,05 % Tween 20, pH 7,4	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)
1x tampon de lavage B : 0,2  ; M Tris, 0,1  ; M NaCl, pH 7,5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
0.01x Tampon de lavage B : 2  ; mM Tris, 1  ; mM NaCl, pH 7,5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Milieu de montage in situ Duolink avec DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040

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