Обнаружение<em> На месте</em> белок-белковых комплексов в<em> Drosophila</em> Личинок нервно-мышечного соединения, используя Пробирной Расстояние Лигирование

Summary

Этот протокол показывает, как Пробирной Расстояние Лигирование может быть использован для обнаружения в точке белок-белковых взаимодействий на Drosophila личиночной нервно-мышечном соединении. С помощью этого метода, Диски большой и Ху-ли тай Шао показаны с образованием комплекса в постсинаптической области, ассоциация ранее выявленных в рамках совместного иммунопреципитацией.

Abstract

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.

Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Introduction

Drosophila Диски большой (DLG) является консервативный член мембраной связаны гуанилатциклазы семейства киназ лесов белков, которые помогают организовать сборку больших белковых комплексов в определенных участках плазматической мембраны. Первоначально идентифицирована как белка-супрессора опухоли, Dlg служит важным фактором, определяющим эпителия апикально-базальной полярности ^1,2,3. Dlg также служит в качестве основного модуля лесов в нервно-мышечном соединении (НМС) глутаматэргических двигательных нейронов во время развития личинок ^4. Dlg играет разные роли на личиночной НМС, и его pleiotropism зависит от его способности, чтобы связать с несколькими белками ^5,6. Одним из таких белков является Ху-ли тай Шао (ВТСП), гомолог к adducins млекопитающих, которые в основном были описаны в отношении их роли в регулировании актин-спектринового цитоскелета ^7. Ранее было показано, что Dlg и Hts может образовывать комплекс друг с другом на основе в пробирке </EM> совместно иммунопреципитации эксперименты с участием всего взрослого летать лизаты ^8. Один из недостатков этих результатов, однако, является то, что они не указывают, когда это сложные формы. С использованием иммуногистохимии, распределения и Dlg Hts наблюдаются перекрываться на постсинаптической мембране личиночных НМС, но они в комплексе в этой области ^8? Как показал недавно и подробно описано здесь, Пробирной Расстояние Лигирование (PLA) используется для поиска в месте связи между Dlg и Hts специально на личиночной NMJ ^27.

PLA является относительно новый метод используется в основном в клеточной и тканевой культуры, которая может обнаружить белок-белковых взаимодействий в месте ^9. В этом анализе, первичные антитела против двух белков, представляющих интерес обнаружены с парой видоспецифических вторичных антител, называют PLA зондов, которые конъюгированы с олигонуклеотидами (1А, В). Если два белкас находятся в непосредственной близости друг от друга (т.е. в течение нескольких десятков нанометров), расстояние между прилагаемыми НОАК зондов можно преодолеть путем гибридизации двух дополнительных олигонуклеотидов Connector (рисунок 1в). В этой конформации, свободные концы соединительных олигонуклеотидов достаточно близки, чтобы вступить в контакт друг с другом, и закрыт круглой молекула ДНК может быть сформирован на месте в лигирования (фиг 1D). Круговой молекула ДНК служит в качестве матрицы для амплификации в месте прокатки круга, который заливают в одном из олигонуклеотидов, конъюгированных с зондами PLA (рис 1E). Последовательности в пределах результате усиленного concatemeric продукта ДНК могут быть визуализированы с флуоресцентно меченных комплементарных олигонуклеотидов (фиг 1F). Поскольку усиленный ДНК остается прикрепленной к одному из датчиков PLA, субклеточном локализации взаимодействия withi белок-белокна ткани могут быть легко установлены.

Некоторые методы широко используются для обнаружения белок-белковых взаимодействий в том числе в технике пробирке, такие как совместно иммунопреципитации, выпадающие анализы и дрожжи Двугибридный анализ и методам естественных условиях, таких как Ферстер резонанс переноса энергии (FRET) и Бимолекулярные флуоресценции комплементации ( BiFC). Ловушка из методов в пробирке, что они не определить, где взаимодействие происходит эндогенно, в то время как вышеупомянутые в естественных условиях методы включают искусственный экспрессию слитых белков, которые могут не отражать родной поведение их эндогенных аналогов. Одно из главных преимуществ PLA является то, что способен определить в ткани на внутриклеточную локализацию эндогенных белков interactors, которые находятся в непосредственной близости друг от друга, и, скорее всего, образующих комплекс с степени близости, необходимой для генерирования сигнала, сравнимой с FRET и BiFC. PLA может обнаружить взаимодействие с высокой специфичностью и чувствительностью за счет сцепления распознавания антител и амплификации ДНК. Таким образом, анализ может генерировать дискретные, яркие сигналы в виде Puncta, которые показывают точное положение взаимодействия. Кроме того, почти видимые антигенов могут быть обнаружены. Наконец, PLA не относительно простой метод для выполнения, и он больше не принимает, чем стандартный иммуногистохимического процедуру для завершения. Поэтому, PLA технические преимущества по сравнению с другими анализами взаимодействия белок-белковых, которые часто сталкивается с длительным временем подготовки и обширной устранения неполадок.

Этот протокол показывает, как PLA могут быть применены к Drosophila личинок НМС с целью обнаружения эндогенных белок-белковых взаимодействий на месте. Здесь PLA осуществляется на личиночных мышц стенки тела препаратов, где Dlg и Hts показаны на самом деле существует в комплексе в постсинаптической области НМС, Народно-освободительная армия ранее не использовалась для изучения личинок НМС, и есть в настоящее время только несколько опубликованных работ, которые использовали эту пробу у дрозофилы ткани. Он выразил надежду, что в дальнейшем экспозиция НОАК сообщества дрозофилы приведет к его увеличению использования в качестве дополнительного инструмента в дополнение к другим, более часто используемые анализы белок-белкового взаимодействия.

Protocol

1. Тело Wall Подготовка Примечание: Получение третьей возрастной стадии стенок тела личинки (для изучения НМС, которые иннервируют мышцы стенки тела) проводили, как описано ранее в Brent и др 10, или Рамачандрана и Будник 11,12, но с некоторыми изменениями.. <…

Representative Results

В дикого типа третьего возраста личинок НМС, Dlg в основном находится на постсинаптической мембране типа I глутаматергических бутонов, а уровни иммунореактивности DLG быть более выражен в вида И. Б. бутонов, чем типа является бутоны (3А) 4. Hts присутствует на всей мышцы, а конце…

Discussion

Этот отчет показывает, как PLA могут быть применены к дрозофилы личиночной НМС. Анализ проводят на личиночных стенки тела препаратов мышечных с целью обнаружения эндогенных белок-белковых взаимодействий, присутствующих в НМС. С помощью этого метода, Dlg и Hts показаны, чтобы быть в неп…

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Forceps (fine #5)	Almedic	A10-704
Sylgard Disc	World Precision Instruments	SYLG184	Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60x15mm petri dish lid when dissecting.
Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter)	Fine Science Tools	26002-10
Microdissection Scissors (ultra fine)	Fine Science Tools	15200-00
Platform Slides			Glue two 22x22mm coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a <20mm gap in between for sample mounting.
w1118	Bloomington Drosophila Stock Center	3605
hts01103	Bloomington Drosophila Stock Center	10989	Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal.
1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7.0			NaH2PO4 (Caledon Laboratories – 8180-1), Na2HPO4 (Caledon – 8120-1), NaCl (Caledon – 7560-1)
Bouin's Solution	Sigma-Aldrich	HT10132
4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS			PFA (Anachemia Science – 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution.
1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton			Triton X-100 (Sigma-Aldrich – T8787)
1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT			BSA (Bioshop Canada – ALB001). Store at 4 °C.
mouse anti-Dlg (Discs large)	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3	Use at a 1:10 dilution in 1% BSA.
rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao)			Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA.
rabbit anti-Pak (p21-activated kinase)			Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA.
mouse anti-Wg (Wingless)	Developmental Studies Hybridoma Bank	4D4	Use at a 1:5 dilution in 1% BSA.
goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase)	Jackson              ImmunoResearch	123-065-021	Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.
FITC-conjugated donkey anti-goat	Jackson             ImmunoResearch	705-095-003	Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.
Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004
Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002
Duolink In Situ Detection Reagents Red	Sigma-Aldrich	DUO92008
1x Wash Buffer A: 0.01M Tris, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific – BP337)
1x Wash Buffer B: 0.2M Tris, 0.1M NaCl, pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1)
0.01x Wash Buffer B: 2mM Tris, 1mM NaCl, pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1)
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040