<em> 전의 VIVO</em> 레이저에 의한 척수 손상 모델은 실시간으로 축삭 변성의 메커니즘을 평가하기 위해
Summary
We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.
Abstract
부상 CNS의 축삭 재생과 자주 떨어져 부상 사이트에서 철회하지 못한다. 초기 부상을 아끼지 축삭 나중에 차 축삭 변성을 거칠 수있다. 척수 내에서 성장 콘 형성, 재생 및 추가 유수 축삭 돌기의 손실의 부족은 크게 손상 후 신경 학적 회복을 제한합니다. 척수의 유수 축삭 부상에 어떻게 반응하는지 중앙 평가하기 위해, 우리의 운명을 문서화하는 노란색 형광 축삭의 단백질과 초점과 재현성이 높은 레이저에 의한 척수 손상을 표현 형질 전환 마우스를 이용한 척수 모델을 살고 생체 개발 두 광자 여기 시간 경과 현미경을 사용하여 축삭과 시간에 수초 (친 유성 형광 염료 나일 레드). 급성 축삭 손상, 축삭 철회하고, 수초 변성 등의 동적 프로세스는 최고의 실시간으로 연구한다. 그러나, 타박상 기반의 부상과 운동 유물의 비 초점 자연 발생고해상도 현미경 도전하여 기본 및 보조 축삭 손상의 반응을 차별화 생체 척수 영상 메이크업 중. 여기에 설명 된 생체 척수 모델은 축삭 부종, 회전 타원체 형성, 축삭 절개, 실시간으로 이러한 역동적 인 과정을 연구하는 유용한 모델을 제공 붓기 근교의 축삭을 포함하여 임상 적으로 관련된 타박상 / 압축에 의한 축삭 병리의 여러 측면을 모방. 이 모델의 주요 장점은 직접 축삭 및 보조 부상 메커니즘을 상해를당한 차 모욕를 구별 할 수 있습니다 우수한 시공간 해상도입니다; 직접 관류 목욕 코드에 시약의 제어 주입; 환경 환경의 정확한 변경 (예를 들어, 칼슘, 나트륨 이온, 축삭 손상에, 거의 불가능에 가까운 영향을 미치는 것으로는 생체 내에서 조작 할 수있는); 그들이 시각화 할 수있는 기회를 제공하고 뮤린 모델로도 이점을 제공하며유전 학적으로 확인 된 세포 집단과 세포 내 구조를 조작 할 수 있습니다. 여기, 우리는 분리하고 이미지가 마우스의 생활 척수 급성 축삭 손상의 역학을 캡처하는 방법에 대해 설명합니다.
Introduction
축삭의 변성은 신경 외상, 뇌졸중,자가 면역 및 신경 퇴행성 질환 등 여러 가지 신경 학적 조건에 걸친 사망률의 저명한 원인이다. 말초 신경계 (PNS), 중추 신경계와는 달리 (CNS) 축색 돌기는 한 번으로 인해 본질과 비 본질 장벽 (즉, 수초 변성 동안 흉터 형성 동안 생산과 해방 축삭의 성장을 억제 분자) (1) 모두에 부상을 재생하는 제한된 능력을 가지고 -7. 이러한 장벽의 여러 가지가 광범위하게 탐구되었지만, 목표로 치료 개입, CNS 축삭 변성을 방지 강력한 축삭 재생을 촉진하고, 기능 접속 식을 복원, 제한 상태로 유지됩니다.
한 번 자신의 소마 분리 축삭 축삭 부종, 회전 타원체의 형성과 (8 검토) 최종 조각이 특징입니다 Wallerian 변성로 알려진 변성에 박힌 과정을 겪는다. 에반면, 가로로 주변 축삭의 소마와 연속성을 유지 근위 루터 이후의 축삭 재생을위한 중요한 전제 조건이 필요, 그 말에 부종을 형성 다시 Ranvier의 가장 가까운 노드에 사망하고 성장 콘 형성을 시작할 수 있습니다 9-11. 반면에, 많은 중앙 축삭의 근위 축삭 엔딩, 특성 "endbulbs"또는 후퇴 전구를 형성 성장 콘을 형성하고, 대신 거리가 부상 12-15 후 몇 개월 동안 남아있는 부상 사이트에서 철회하지 못한다. 기본 축삭 손상뿐만 아니라, 추가 축삭 손상 / 손실은 크게 초기 부상에서 겪었던 축삭 발생할 수 있습니다. 처음 아끼지 축삭이 지연 축삭 손실은 보조 축삭 변성이라고한다. 부상 CNS 축삭이 고유 응답 기능 축삭 재생을 뇌와 척수에 달성하기 위해 훨씬 더 어려운 목표를 렌더링합니다.
하,하지만축삭 손상 (예를 들어, 회전 타원체 형성, 후퇴 전구)의 llmarks 잘 사후 조직 및 축삭 변성의 실험 모델에서 특성화되었다, 이러한 동적 프로세스를 기본 분자 메커니즘의 해명이 제한되었습니다. 이러한 연구의 대부분은 본질적으로 시간이 지남에 따라 개별 축삭 반응을 포착하는 데 실패 정적 엔드 포인트 관찰에 의존했다. 비록 외생 축삭 추적자 정적 섹션에서 라이브 영상 중 축삭 반응을 규명하는 데 유용왔다 적용, 유전자 인코딩 된 축삭 마커의 가용성은 형광 현미경을 사용하여 실시간으로 축삭을 시각화하는 능력을 크게 향상했다. 실제로, Kerschensteiner 및 동료 정액 보고서는 먼저 척추의 등 열에서 자신의 전망을 보내 뉴런의 부분 집합에 녹색 형광 단백질을 인코딩 Thy1 -GFP-S 마우스를 사용하여 생체 내에서 축삭 변성 및 재생의 직접적인 증거를 제공코드 (16). 라이브 영상은 두 개의 광자 레이저 스캐닝 현미경 (TPLSM)를 사용하여 접근과 관심의 세포의 유전자 형광 단백질 표지는 축삭 변성, 칼슘 신호, 축삭 재생, 성상 세포 생리학 많은 다양한 동적 프로세스에 직접 증거와 기계적인 통찰력을 제공하고 미세 아교 세포 생리학, 부상 17 ~ 25에 대한 응답.
축삭 대조적으로, 거의 실시간으로 부상 미엘린 응답의 공지되어있다. 미엘린은 PNS에서 CNS와 슈반 세포에서 희소 돌기 아교 세포에 의해 생산 및 유지 백질의 중요한 구성 요소입니다. 수초는 축삭의 표면의 99 %을 절연하고 그렇게함으로써 최근 Buttermore 등. (26)에 의해 검토 신속하고 효율적으로 도약적인 충동 전달을 지원하는 고 저항, 낮은 커패시턴스 보호 커버를 제공한다. 우리가 solvatochromic, 친 유성을 사용하여 부상 수초의 동적 응답을 캡처하려면형광 염료 나일 레드 (27). 이 중요한 얼룩의 solvatochromic 속성은 물리 화학적 환경 (28, 29)에 따라 자사의 발광 스펙트럼의 스펙트럼 변화를 할 수 있습니다. 이러한 속성은 axomyelinic 부상의 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 유용하고 적절하게 선택 dichroics 및 배출 필터를 사용하여 시각 또는 스펙트럼 현미경 (27)를 사용하여 해결할 수 있습니다. 예를 들면, 나일 레드의 발광 스펙트럼은 청색 시프트 등의 지방 세포 및 CNS의 정상 미엘린 (발광 피크 ~ 580-590 ㎚) (27)에있는 것과 같이 덜 극성 지질이 풍부한 환경에서이다. 반면에, ~ 625 nm의 축색 돌기로 형성 endbulbs의에서이 중요한 염료의 발광 스펙트럼의 피크는 축삭 dieback (27)를 받아야. 보통 수초 대 endbulbs에 특별히 이러한 스펙트럼 변화의 기초가되는 정확한 메커니즘은 불분명하지만, 이러한 스펙트럼 변화는 단백질의 축적 또는 해체로 이어지는에서 기본 변경을 표시 할 수있다소수성 결합 부위 (27)의 노출.
생체 내 이미징 자신의 네이티브 환경에서 척수 축삭 손상 역학을 관찰 궁극적 인 메트릭이 있지만, 기술적으로 도전하고 실질적인 수술 전문 지식을 필요로하고, 자주 (예를 들어, 염증과 흉터를 실험 유물을 소개 할 수있다 등의 열을 노출하는 수술을 반복 형성). 또한, 고가의 장비는 종종 현미경 대물 렌즈 아래 그대로 동물의 현탁액 및 위치를 허용하도록 요구된다. 동물은 신중하게 체액이 보충되어 있는지 확인하고, 때문에 장시간 마취 이미징 세션에 저산소증의 징후가 없는지 확인하기 위해, 따뜻한 유지하기 위해뿐만 아니라 모니터링 할 필요가있다. 축삭과 수초가 절대적으로 생존을 유지하기 위해 지속적인 관류하고 적절한 산소 수준을 필요로 후자는 매우 중요하다. 그러나이 종종보고 또는 생체 내 연구에서 대부분의 모니터되지 않습니다날짜. 또한 인한 심박수 및 호흡 운동 아티팩트 (이소 플루 란 성인 마우스를 마취 ~ 분당 300-450 비트 (BPM)을 97~98% 산소 포화도 (정상 속도 ~ 632 BPM) 및 유지에 적합하다 ~ 55-65 호흡 분 당 불가피하게 이러한 움직임 될 수 있습니다 각각)) (30)는 심지어 가장 빠른 레이저 스캔에 도전 고해상도 형광 현미경을 사용하여 기본 및 보조 축삭 손상의 반응을 차별화 생체 척수 영상 메이크업 중 발생 (정상 속도는 ~ 163 분당 호흡이다) 유물. 웨이크 동물 뮤린 척수의 이미징을 허용 할 수 척추 이식 강성 프레임 윈도우와 결합 공진 초고속 스캐너 진보하지만, 빠른 스캔 시간은 필연적 잡음비 저하 화상 신호 품질을 감소시킨다. 현재와 같은 뇌 영상에 사용되는 척수 이미징 기술의 추가 개선이 많은 장애물을 극복하고 INA에 의해 도입 된 잠재적 인 혼동을 제한 할 수있다dequate 조직 관류, 예를 들어, 31 ~ 33.
백질 생리학과 백질 손상의 메커니즘에 대해 알려진의 대부분은 시험관 또는 시신경, 말초 신경, 척수 백질 34-41의 스트립에서 흰색 물질의 체외 준비에 사용하여 결정되었습니다. 이 환경 요인의 변화, 조직 생활에서 약물 및 시약의 제어 응용, 전기 생리학을 사용하여 기능성 평가 및 축삭의 직접 형광 현미경 관찰과 수초를 제어 허용 이러한 준비는 백질 손상 메커니즘에 대한 지식을 사전에 계속. 그러나, 일부 이전 방식은 불가피 밀접하게 반대 축삭의 응답에 영향을 미칠 수 제거 단계에서 표면 축삭 손상 척수 등의 열 스트립 또는 복부 백질 스트립에서 축색 돌기를 관찰한다. 위의 실험 조작에 투자하고는했습니다의 손상을 방지하려면이 코드의 등 측면의 직접 접촉을 방지로 조사중인 공예 섬유, 우리는 생체 자궁 경부 척추 모델을 사용하고 있습니다. 따라서, 피아 교인 인접 표면 등의 열 축색 돌기의 구조는 분리시 실행 가능하고 교란 남아있다.
손상 후 10 + 시간 – 여기에서 우리는 동적으로 최대 8 실시간으로 초점 부상으로 응답으로 중앙 유수 축삭의 직접 시각화 할 수있는 비교적 간단한 방법을 설명합니다. 레이저에 의한 척수 손상 (LiSCI) 모델은 공간적으로 시간이 지남에 제약이 남아 기본 병변 (절제 사이트)와 같은 기본 및 보조 축삭 손상 메커니즘 사이의 차별화를 할 수 있습니다. 오픈 목욕 영상 챔버는 치료 적 개입, 시약 전달, 환경 조작에 액세스 할 수 있습니다. 추정 axomyelinic 보호제 빠르게 조직 프로세스와 관련된 비용과 시간이 소요 실험 대 직접 관찰하여 실시간으로 평가 될 수있다ING 따라서, 면역 염색, 화상 캡쳐 및 분석하여 절편과 살아있는 동물 실험에서 에이전트를 테스트하기 전에 급성 반응과 보호 조작을 평가하는 유용한 대리 모델을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 표면의 영상 생체 척수 유수 축삭 (즉, 날씬한 다발)은 시간이지나면서 모두 기본 및 보조 유수 축삭 변성의 동적 진행을 연구하기 위해 레이저에 의한 척수 손상과 함께. 생체 내 이미징 방법을 설명 척수 모션 아티팩트 및 장시간 촬상 세션 동안 실험자 저산소증 유발 전위 생체 이미징과 관련된 합병증의 많은 것을 극복한다. 이 프로토콜은 산소 관류 낮은 칼?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DPS acknowledges past and present support in part from grant #2665 and #2934, respectively, from the PVA Research Foundation. PKS is an Alberta Innovates – Health Solutions Scientist, operating funds were provided by the Leblanc Chair for Spinal Cord Research, University of Calgary.
Materials
| Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Large bath chamber with slice supports | Warner Instruments | RC-27L | For ex vivo imaging chamber |
| Standard Slice Supports | Warner Instruments | SS-3 | For ex vivo imaging chamber |
| Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers | Warner Instruments | SHD-27LP/10 | For ex vivo imaging chamber |
| Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed | Warner Instruments | ST-1L | For ex vivo imaging chamber |
| Solution In-line heater/cooler | Warner Instruments | SC-20 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | CL-100 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Liquid Cooling System | Warner Instruments | LCS-1 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | CC-28 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Replacement bead thermisitor for CC-28 cable | Warner Instruments | TS-70B | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Magnetic holder with suction tubing | Bioscience Tools | MTH-S | To hold the stainless steel vacuum suction tubing |
| Adjustable holder | Bioscience Tools | MTH | To hold the temperature probe |
| clear silicone sealant | For ex vivo imaging chamber | ||
| superglue | For ex vivo imaging chamber | ||
| thin plexiglass strips | For ex vivo imaging chamber | ||
| nile red | Life Technologies | N-1142 | For labeling myelin |
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