Método quirúrgico para la entrega de genes mediada por virus de la oreja del ratón Interior a través de la ventana de membrana Ronda
Summary
The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.
Abstract
La terapia génica, que se utiliza para lograr la recuperación funcional de la sordera neurosensorial, se compromete a conceder una mejor comprensión de los mecanismos moleculares y genéticos subyacentes que contribuyen a la pérdida de la audición. Introducción de vectores en el oído interno debe hacerse de una manera que distribuye ampliamente el agente a lo largo de la cóclea al tiempo que minimiza la lesión a las estructuras existentes. Este manuscrito describe un enfoque quirúrgico post-auricular que se puede utilizar para la terapia coclear ratón usando molecular, farmacológica, y la entrega viral a ratones día postnatal 10 y mayores a través de la membrana de la ventana redonda (RWM). Este abordaje quirúrgico permite una entrega rápida y directa en la rampa timpánica y reducir al mínimo la pérdida de sangre y evitar la mortalidad de los animales. Esta técnica implica un daño insignificante o no a las estructuras esenciales del oído medio e interno, así como los músculos del cuello, mientras su totalidad preservar la audición. Para demostrar la eficacia de esta técnica quirúrgica, el glutam vesicularcomió transportador 3 knockout (KO VGLUT3) los ratones se utilizará como un ejemplo de un modelo de ratón de la sordera congénita que recupera la audición después de la entrega de VGLUT3 al oído interno utilizando un virus adeno-asociado (AAV-1).
Introduction
La terapia génica durante mucho tiempo ha sido sugerido como un posible tratamiento para la pérdida auditiva genética, pero el éxito en esta área ha sido difícil de alcanzar 1. Hasta la fecha, las metodologías mediadas por virus han predominado por la capacidad teórica para dirigirse a tipos específicos de células dentro de la cóclea relativamente inaccesible. Ambos adenovirus (AV) y el virus adeno-asociado (AAV) se han utilizado para la entrega de genes coclear. AAV son ventajosos en la cóclea por un número de razones. Ellos son virus deficientes en la replicación y pueden transferir de manera eficiente moléculas transgénicos para diferentes tipos de células incluyendo neuronas, un objetivo importante para un número de causas de la pérdida de audición. Entrada AAV en la célula está mediada por receptores específicos 2; Por lo tanto, la elección de un serotipo particular, debe ser compatible con los tipos de células a ser transducidas. AAV puede transfectar eficazmente células ciliadas 3 e incorporar en el genoma del huésped, lo que resulta en una expresión estable y a largo plazo de la traproteína nsgenic y cambio fenotípico en la celda 4. Aunque no necesariamente ventajoso para aplicaciones de corto plazo, tales como la regeneración de células de pelo, expresión a largo plazo es muy importante para el rescate estable de defectos genéticos. Debido AAV no están asociados con ninguna enfermedad humana o infección y demuestran no ototoxicidad 5,6,7, son un candidato ideal para su uso en la terapia génica para formas heredadas de la pérdida de audición 8.
Transferencia de material genético exógeno en el oído interno de los mamíferos utilizando vectores virales se ha estudiado en la última década y se perfila como una técnica prometedora para el tratamiento de las formas tanto genéticas y adquiridas de la pérdida de 9 de la audición. La cóclea es potencialmente una diana ideal para la terapia génica por varias razones: 1) su volumen pequeño requiere una cantidad limitada de que el virus sea necesario; 2) su relativo aislamiento de otros efectos secundarios límites del sistema de órganos; y 3) sus cámaras llenas de líquido facilitan viralentrega en todo el laberinto 10, 11,12,13,14, 15.
Los modelos de ratón de la sordera congénita permiten el uso de muchos métodos de estudio para monitorear el desarrollo del oído interno de una manera sistemática, replicable. Mientras que el pequeño tamaño de cochleae ratón no presenta cierta dificultad quirúrgica, el ratón sirve como un modelo extremadamente importante en el estudio de la pérdida auditiva genética, con varias ventajas sobre otras especies experimentales 16. Los modelos de ratón permiten la evaluación de una serie de características a través de análisis de ligamiento genético, colección de observaciones morfológicas detalladas, y la simulación de escenarios patógenos; Como tales, son buenos candidatos para la terapia génica mediada por virus. Extensos estudios genéticos en ratones combinados con los avances tecnológicos han hecho posible la generación de ratones modificados genéticamente de forma reproducible a través de laboratorios de 17,18, 19, 20,21. Furthermore, existen numerosos modelos para ambos adquiridas y heredadas de la audición fenotipos de pérdida en ratones, lo que permite a rigurosas pruebas en este modelo animal 22, 23,24. Por lo tanto, la corrección de la audición mediante la terapia génica mediada por virus en un modelo de ratón es un primer paso apropiado en la búsqueda de una cura para la enfermedad humana.
Hemos demostrado previamente que los ratones transgénicos que carecen de glutamato vesicular transportador 3 (VGLUT3) nacen sordos debido a la falta de liberación de glutamato en la sinapsis cinta IHC 25. Debido a que esta mutación no conduce a una degeneración primaria de las células ciliadas sensoriales, estos ratones mutantes son potencialmente un excelente modelo en el que para probar la terapia génica coclear para la pérdida de audición congénita.
Hasta la fecha, un número de técnicas de administración virales para la terapia génica coclear se han descrito, incluyendo la difusión membrana de la ventana redonda, la inyección de membrana de la ventana redonda, y la entrega a través de una cocleostomía. Hay potenteventajas ial y desventajas de cada uno de estos enfoques 9.
Aquí mostramos un método quirúrgico para la entrega de genes mediada por virus en el oído interno VGLUT3 KO ratón a través de la membrana de la ventana redonda (RWM). El método de inyección de RWM post-auricular es mínimamente invasiva con la preservación audiencia excelente, y es relativamente rápido. Como hemos publicado anteriormente, en un esfuerzo para restaurar la audición en este modelo de ratón, un vector de AAV1 que lleva el gen VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) se introdujo en la cóclea de estos ratones sordos en el día postnatal 12 (P! @), Resultando en la restauración de la audición 26. Audición en los ratones KO VGLUT3 se verificó por la respuesta del tronco encefálico (ABR), mientras que la expresión de proteínas transgén se verificó mediante inmunofluorescencia (IF). Por tanto, esta metodología demuestra que la terapia génica mediada por virus-puede corregir un defecto genético que de otro modo resulta en sordera.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este trabajo, se describe en detalle una técnica que se puede utilizar para la terapia génica coclear, con el objetivo de restaurar o rescatar la función auditiva normal que se ve comprometida por un defecto genético. Como es típicamente atraumática, este enfoque es seguro para la transferencia de genes coclear u otras terapias moleculares potenciales 30. Se han descrito otros enfoques para la terapia coclear, incluyendo un enfoque ventral 24, cocleostomía 31,32 y el saco endol…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by an R21 grant from the National Institutes of Health and by a grant from Hearing Research, Incorporated.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Butler Schein | ||
| Xylazine | AnaSed | ||
| Acepromazine | Provided by UCSF LARC | ||
| Carprofen analgesia | Provided by UCSF LARC | ||
| Betadine | Betadine Puredue Pharma | ||
| dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | ||
| Heating pad | Braintree scientific, inc. | ||
| 25G needle | BD | 305127 | |
| Borosilicate capillary pipette | World precision instruments, inc. | 1B100F-4 | |
| Suture PDS*plus Antibacterial | Ethicon | PDP149 | |
| Tissue glue (Vetcode) | Butler Schein | 31477 | |
| Rabbit Anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Flaming/ Brown Micropipette | Sutter Instrument Co | ||
| Puller Model P-97 | |||
| TDT BioSig III System | Tucker-Davis Technologies |
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