الطريقة الجراحية لفيروسي وساطة جين التسليم إلى الأذن الداخلية الماوس من خلال جولة النافذة غشاء
Summary
The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.
Abstract
العلاج الجيني، وتستخدم لتحقيق الانتعاش وظيفية من الصمم الحسي العصبي، وعود بمنح فهم أفضل للآليات الجزيئية والجينية الأساسية التي تساهم في فقدان السمع. ويجب أن يتم إدخال ناقلات في الأذن الداخلية بطريقة توزع على نطاق واسع وكيل في جميع أنحاء القوقعة مع التقليل من إصابة في الهياكل القائمة. توضح هذه المخطوطة نهج الجراحي بعد أذني التي يمكن استخدامها للماوس العلاج القوقعة باستخدام الجزيئية، الصيدله، والتسليم الفيروسي على الفئران يوم ما بعد الولادة 10 وكبار السن عبر النافذة غشاء الجولة (RWM). هذا النهج الجراحي يمكن التسليم السريع والمباشر إلى طبلة الأذن سكالا مع تقليل فقدان الدم وتجنب نفوق الحيوانات. هذه التقنية تنطوي على ضرر يذكر أو لا للهياكل الأساسية في الأذن الداخلية والوسطى وكذلك عضلات الرقبة بالكامل مع الحفاظ على السمع. للتدليل على فعالية هذه التقنية الجراحية، وglutam حويصليأكل نقل ستستخدم 3 خروج المغلوب (VGLUT3 KO) الفئران كمثال على نموذج الفأر من الصمم الخلقي أن يسترد السمع بعد الولادة من VGLUT3 إلى الأذن الداخلية باستخدام فيروس الغدة المرتبطة (AAV-1).
Introduction
منذ فترة طويلة واقترح العلاج الجيني كعلاج محتمل لفقدان السمع الوراثية، ولكن ظلت النجاح في هذا المجال بعيد المنال 1. حتى الآن، وقد سادت منهجيات بوساطة فيروسي بسبب القدرة النظرية لاستهداف أنواع معينة من الخلايا داخل القوقعة التي يتعذر الوصول إليها نسبيا. وقد استخدمت كل من اتش (AV) وفيروس الغدة المرتبطة (AAV) لتوصيل الجينات القوقعة. AAVs هي مفيدة في القوقعة لعدد من الأسباب. وهي فيروسات النسخ ناقصة ويمكن نقل الجزيئات المعدلة وراثيا بكفاءة لأنواع مختلفة من الخلايا بما في ذلك الخلايا العصبية، هدف هام لعدد من الأسباب المؤدية إلى فقدان السمع. وتوسطت دخول AAV في الخلية التي كتبها مستقبلات محددة 2. وبالتالي، يجب أن يكون اختيار النمط المصلي خاص متوافق مع أنواع الخلايا إلى أن transduced. يمكن AAVs بالنقل فعال خلايا الشعر (3) وتدرج في الجينوم المضيف، مما أدى إلى مستقر، والتعبير على المدى الطويل من هيئة تنظيم الاتصالاتnsgenic البروتين والتغير المظهري في الخلية 4. في حين لا فائدة بالضرورة لتطبيقات قصيرة الأجل مثل تجديد خلايا الشعر، والتعبير على المدى الطويل هو مهم جدا لإنقاذ مستقر من عيوب وراثية. لأن لا ترتبط AAVs مع أي مرض أو عدوى الإنسان وإظهار أي تسميم أذني 5،6،7، فهي مرشحا مثاليا للاستخدام في العلاج الجيني لأشكال الموروثة من فقدان 8 السمع.
وقد تمت دراسة نقل المادة الوراثية الخارجية إلى الأذن الداخلية الثدييات باستخدام ناقلات فيروسية خلال العقد الماضي، ويبرز بوصفه تقنية واعدة لعلاج أشكال كلا الوراثية والمكتسبة للخسارة 9 السمع. القوقعة يحتمل أن تكون هدفا مثاليا للعلاج بالجينات لعدة أسباب: 1) يتطلب حجمه صغير كمية محدودة من الفيروس الحاجة؛ 2) عزلتها النسبية عن غيرها من آثار حدود أجهزة الجسم الجانب. و3) غرف مملوءة بسائل في تسهيل الفيروسيةتسليم جميع أنحاء المتاهة 10، 11،12،13،14، 15.
نماذج الماوس من الصمم الخلقي تسمح لاستخدام العديد من أساليب الدراسة إلى رصد التنمية في الأذن الداخلية و بطريقة قابلة للتكرار منهجية. في حين أن صغر حجم الماوس القوقعة لا يقدم بعض الصعوبة الجراحية، ويعمل الماوس باعتبارها نموذجا هاما للغاية في دراسة فقدان السمع الوراثية، مع العديد من المزايا التجريبية على الأنواع الأخرى (16). نماذج الماوس تسمح بتقييم مجموعة من الخصائص من خلال التحليل الجيني الربط، وجمع من الملاحظات الشكلية مفصلة، ومحاكاة سيناريوهات المسببة للأمراض. على هذا النحو، فهي مرشحة جيدة للعلاج بالجينات بوساطة فيروسي. جعلت الدراسات الجينية واسعة في الفئران جنبا إلى جنب مع التقدم التكنولوجي من الممكن لتوليد الفئران المعدلة وراثيا بطريقة استنساخه في المختبرات 17،18، 19، 20،21. Furthermorه، توجد العديد من النماذج على حد سواء المكتسبة والموروثة سماع الظواهر الخسارة في الفئران، مما يسمح للاختبارات صارمة في هذا النموذج الحيواني 22، 23،24. وهكذا، وتصحيح السمع باستخدام العلاج الجيني بوساطة فيروسي في نموذج الفأر هو خطوة أولى المناسبة في البحث عن علاج لمرض البشري.
لقد أظهرنا سابقا أن الفئران المعدلة وراثيا التي تفتقر إلى نقل الغلوتامات حويصلي 3 (VGLUT3) يولدون الصم بسبب عدم الإفراج الغلوتامات في IHC الشريط المشبك 25. لأن هذه الطفرة لا يؤدي إلى انحطاط الأساسي للخلايا الشعر الحسية، هذه الفئران الطافرة يمكن أن تكون نموذجا ممتازا فيها لاختبار العلاج الجيني قوقعة لفقدان السمع الخلقية.
حتى الآن، وقد وصفت عدد من التقنيات تسليم الفيروسية للعلاج بالجينات القوقعة، بما في ذلك جولة نشر نافذة الغشاء، مستديرة حقن نافذة الغشاء، والتسليم عن طريق فغر القوقعة. هناك قويةمزايا وعيوب كل من هذه الأساليب 9 الاتحاد العالمي للتعليم.
نحن هنا الإبلاغ عن طريقة جراحية للتوسط فيروسي توصيل الجينات إلى الأذن الداخلية VGLUT3 KO الماوس من خلال النافذة غشاء الجولة (RWM). وبعد أذني طريقة الحقن RWM هو الغازية الحد الأدنى مع الحفاظ على جلسة ممتازة، وسريع نسبيا. كما نشرنا سابقا، في محاولة لاستعادة السمع في هذا النموذج الماوس، تم إدخال ناقلات AAV1 تحمل الجين VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) في القوقعة من هذه الفئران صماء في يوم ما بعد الولادة 12 (P! @)، مما أدى إلى استعادة السمع 26. السمع في الفئران VGLUT3 KO تم التحقق من استجابة الدماغ السمعية (ABR)، في حين تم التحقق من البروتين التحوير التعبير باستخدام المناعي (IF). وهكذا يوضح هذه المنهجية أن العلاج الجيني بوساطة فيروسي يمكن أن تصحح الخلل الجيني التي من شأنها أن يؤدي خلاف ذلك في الصمم.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا العمل، نحن تصف بالتفصيل تقنية التي يمكن استخدامها للعلاج بالجينات القوقعة، وذلك بهدف استعادة أو إنقاذ وظيفة السمع العادية التي تتعرض للخطر من قبل خلل جيني. كما هو ارضحي عادة، وهذا النهج هو آمن لنقل الجين القوقعة أو العلاجات الجزيئية المحتملة الأخرى 30. و?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by an R21 grant from the National Institutes of Health and by a grant from Hearing Research, Incorporated.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Butler Schein | ||
| Xylazine | AnaSed | ||
| Acepromazine | Provided by UCSF LARC | ||
| Carprofen analgesia | Provided by UCSF LARC | ||
| Betadine | Betadine Puredue Pharma | ||
| dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | ||
| Heating pad | Braintree scientific, inc. | ||
| 25G needle | BD | 305127 | |
| Borosilicate capillary pipette | World precision instruments, inc. | 1B100F-4 | |
| Suture PDS*plus Antibacterial | Ethicon | PDP149 | |
| Tissue glue (Vetcode) | Butler Schein | 31477 | |
| Rabbit Anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Flaming/ Brown Micropipette | Sutter Instrument Co | ||
| Puller Model P-97 | |||
| TDT BioSig III System | Tucker-Davis Technologies |
References
- Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum. Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
- Nam, H. J., et al. Structure of adeno-associated virus serotype 8, a gene therapy vector. J. Virol. 81 (22), 12260-12271 (2007).
- Ryan, A. F., Mullen, L. M., Doherty, J. K. Cellular targeting for cochlear gene therapy. Adv Otorhinolaryngol. 66, 99-115 (2009).
- Xia, L., Yin, S., Wang, J. Inner ear gene trasfection in neonatal mice using adeno-associate viral vwctor: a comparison of two approaches. PLoS One. 7 (8), e43218 (2012).
- Husseman, J., Raphael, Y. Gene therapy in the inner ear using adenovirus vectors. AdvOtorhinolaryngol. 66, 37-51 (2009).
- Ballana, E., et al. Efficient and specific transduction of cochlear supporting cells by adeno-associated virus serotype 5. Neurosci. Lett. 442 (2), 134-139 (2008).
- Praetorius, M., et al. Adenoviral vectors for improved gene delivery to the inner ear. Hear. Re. 248 (1-2), 31-38 (2009).
- Kay, M. A., Glorioso, C. G., Naldini, L. Viral vectors for gene therapy: the art of turning infectious agents into vehicles of therapeutics. Nature Medicine. 7 (1), 33-40 (2001).
- Kesser, B. W., Lalwani, A. K., Ryan, A. F. Gene Therapy and Stem Cell Transplantation: Strategies for Hearing Restoration. Adv Otorhinolaryngol. 66, 64-86 (2009).
- Cooper, L. B., et al. AAV-mediated delivery of the caspase inhibitor XIAP protects against cisplatin ototoxicity. Otol. Neurotol. 27 (4), 484-490 (2006).
- Gratton, M. A., Salvi, R. J., Kamen, B. A., Saunders, S. S. Interaction of cisplatin and noise on the peripheral auditory system. Hear. Res. 50 (1-2), 211-223 (1990).
- Lalwani, A. K., Walsh, B. J., Reilly, P. G., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).
- Kesser, B. W., Hashisaki, G. T., Holt, J. R. Gene Transfer in Human Vestibular Epithelia and the Prospects for Inner Ear Gene Therapy. Laryngoscope. 118 (5), 821-831 (2008).
- Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat. Med. 11 (3), 271-276 (2005).
- Praetorius, M., et al. Adenovector-mediated hair cell regeneration is affected. Acta Otolaryngol. 130 (2), 215-222 (2009).
- Friedman, L. M., Dror, A. A., Avraham, K. B. Mouse models to study inner ear development and hereditary hearing loss. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 609-631 (2007).
- Chang, E. H., Van Camp, G., Smith, R. J. The role of connexins in human disease. Ear Hear. 24 (4), 314-323 (2003).
- Cohen-Salmon, M., et al. Targeted ablation of connexin26 in the inner ear epithelial gap junction network causes hearing impairment and cell death. Curr. Biol. 12 (13), 1106-1111 (2002).
- Nickel, R., Forge, A. Gap junctions and connexins in the inner ear: their roles in homeostasis and deafness. Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 16 (5), 452-457 (2008).
- Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. J. Biol. Chem. 285 (45), 34699-34707 (2010).
- Leibovici, M., Safieddine, S., Petit, C. Mouse models for human hereditary deafness. Curr. Top. Dev. Biol. 84, 385-429 (2008).
- Dror, A. A., Avraham, K. B. Hearing loss: mechanisms revealed by genetics and cell biology. Annu. Rev. Genet. 43, 411-437 (2009).
- Richardson, G. P., de Monvel, J. B., Petit, C. How the genetics of deafness illuminates auditory physiology. Annu. Rev. Physiol. 73, 311-334 (2011).
- Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse. Hearing Research. 151 (1-2), 106-114 (2001).
- Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
- Akil, O., et al. Progressive deafness and altered cochlear innervation in knock-out mice lacking prosaposin. J. Neurosci. 26 (5), 13076-13088 (2006).
- Fremeau, R. T., et al. Vesicular glutamate transporters 1 and 2 target to functionally distinct synaptic release sites. Science. 304 (5678), 1815-1819 (2004).
- Akil, O., Lustig, L. R. Mouse Cochlear Whole Mount Immunofluorescence. Bio-protocol. , (2013).
- Kho, S. T., Pettis, R. M., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Cochlea microinjection and its effects upon auditory function in guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).
- Iizuka, T., et al. Noninvasive in vivo delivery of transgene via adeno-associated virus into supporting cells of the neonatal mouse cochlea. Hum. Gene Ther. 19 (4), 384-390 (2008).
- Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
- Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner Ear Transgene Expressionafter Adenoviral Vector Inoculation in the Endolymphatic Sac Hum. Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
- Praetorius, M., Baker, K., Weich, C. M., Plinkert, P. K., Staecker, H. Hearing preservation after inner ear gene therapy: the effect of vector and surgical approach. ORL J. Otorhinolaryngol. Relat. Spec. 65 (4), 211-214 (2003).
- Carvalho, G. J., Lalwani, A. K. The effect of cochleaostomy and intracochlear infusion on auditory brain stem response threshold in the guinea pig. Am. J. Otol. 20 (1), 87-90 (1999).
- Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The Functional and Structural Outcome of Inner Ear Gene Transfer via the Vestibular and Cochlear Fluids in Mice. Mol. Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
- Lalwani, A. K., Han, J. J., Walsh, B. J., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Green fluorescent protein as a reporter for gene transfer studies in the cochlea. Hear Res. 114 (1-2), 139-147 (1997).
- Lalwani, A. K., et al. Long-term in vivo cochlear transgene expression mediated by recombinant adeno-associated virus. Gene Ther. 5 (2), 277-281 (1998).
- Raphael, Y., Frisancho, J. C., Roessler, B. J. Adenoviral-mediated gene transfer into guinea pig cochlear cells in vivo. Neurosci. Lett. 207 (2), 137-141 (1996).
- Weiss, M. A., Frisancho, J. C., Roessler, B. J., Raphael, Y. Viral mediated gene transfer in the cochlea. Int. J. Dev. Neurosci. 15 (4=5), 577-583 (1997).
- Pettis, R. M., Han, J. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Intracochlear infusion of recombinant adeno associated virus: Analysis of its dissemination to near and distant tissues. Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. 21, 673 (1998).
- Konish, i. M., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors. J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).
