Chirurgische methode voor viraal gemedieerde Gene Levering aan de Mouse Inner Ear door het ronde venster membraan

Summary

The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.

Abstract

Gentherapie, gebruikt om functioneel herstel van sensorineurale doofheid te bereiken, belooft beter begrip van de onderliggende moleculaire en genetische mechanismen die bijdragen aan gehoorverlies verlenen. Introductie van vectoren in het binnenoor moet gebeuren op een wijze die algemeen verdeelt middel door de cochlea met minimale schade aan de bestaande structuren. Dit manuscript beschrijft een post-auriculaire chirurgische benadering die kan worden gebruikt voor muizen cochleaire therapie met moleculaire, farmacologische en virale levering aan muizen postnatale dag 10 en ouder via het ronde venster membraan (RWM). Deze chirurgische benadering maakt een snelle en directe levering in de scala tympani terwijl het minimaliseren van bloedverlies en sterfte van dieren te voorkomen. Deze techniek houdt verwaarloosbaar of geen schade aan essentiële structuren van de binnenste en middenoor evenals nekspieren terwijl volledig behoud gehoor. Om de effectiviteit van deze chirurgische techniek, vesiculaire glutam tonenat transporter 3 knockout (VGLUT3 KO) muizen zullen worden gebruikt als een voorbeeld van een muismodel van doofheid die herstelt horen na aflevering van VGLUT3 het binnenoor via een adeno-geassocieerd virus (AAV-1).

Introduction

Gentherapie is al lang voorgesteld als een potentiële behandeling voor genetische gehoorverlies, maar het succes op dit gebied is ongrijpbaar ¹ gebleven. Tot op heden zijn viraal gemedieerde methoden overheerst vanwege de theoretische mogelijkheid om specifieke celtypen te richten binnen de betrekkelijk ontoegankelijke cochlea. Beide adenovirus (AV) en adeno-geassocieerde virus (AAV) zijn gebruikt voor cochleaire genafgifte. AAV's zijn voordelig in het slakkenhuis voor een aantal redenen. Ze zijn replicatie-deficiënte virussen en efficiënt overbrengen transgene moleculen aan verschillende celtypen waaronder neuronen, een belangrijk doelwit voor een aantal oorzaken van gehoorverlies. AAV binnenkomst in de cel wordt gemedieerd door specifieke receptoren ^2; Zo mag de keuze van een bepaald serotype verenigbaar met de celtypen worden getransduceerd. AAVs effectief transfecteren haarcellen ³ en integreren in het gastheergenoom, resulteert in stabiele, lange-termijn expressie van het transgenic eiwit en fenotypische verandering in de cel ^4. Hoewel niet noodzakelijk voordelig voor korte termijn toepassingen zoals haar-celregeneratie lange termijn expressie is erg belangrijk voor bergingschoot van genetische defecten. Omdat AAVs niet worden geassocieerd met een menselijke ziekte of infectie en tonen geen ototoxiciteit ^5,6,7, zijn ze een ideale kandidaat voor gebruik in gentherapie voor erfelijke vormen van gehoorverlies ^8.

Overdracht van exogeen genetisch materiaal in de zoogdierbinnenoorsteuncellen behulp van virale vectoren is onderzocht de afgelopen tien jaar en is in opkomst als een veelbelovende techniek voor de behandeling van zowel genetische en verworven vormen van gehoorverlies ^9. De cochlea is potentieel een ideaal doelwit voor gentherapie voor verschillende redenen: 1) het kleine volume vereist een beperkte hoeveelheid van het virus nodig is; 2) het relatieve isolement van andere orgaansystemen grenzen bijwerkingen; en 3) de met vloeistof gevulde kamers vergemakkelijken viraleverzending binnen heel het labyrint ^{10, 11,12,13,14, 15.}

Muismodellen van aangeboren doofheid zorgen voor het gebruik van vele methoden van onderzoek te bewaken ontwikkeling van het binnenoor op een systematische, herhaalbare manier. Terwijl de kleine omvang van muis cochleae inhoudt sommige chirurgische moeilijkheid, de muis fungeert als een zeer belangrijk model voor de studie van genetische gehoorverlies, met verschillende experimentele voordelen boven andere soorten ^16. Muismodellen voor evaluatie van een reeks kenmerken door middel van genetische linkage analyse, verzamelen van gedetailleerde morfologische waarnemingen, en pathogene's simuleren; als zodanig zijn ze goede kandidaten voor viraal gemedieerde gentherapie. Uitgebreide genetische studies bij muizen combinatie met technologische ontwikkelingen hebben het mogelijk genetisch gemodificeerde muizen gegenereerd op een reproduceerbare wijze in laboratoria ^{17,18, 19, 20,21.} VOORTSe, bestaan ​​er tal van modellen voor zowel verworven en erfelijke gehoorverlies fenotypes bij muizen, waardoor strenge testen in dit diermodel ^{22, 23,24.} Zo, het corrigeren gehoor behulp van viraal gemedieerde gentherapie in een muismodel is een geschikte eerste stap in de zoektocht naar genezing van ziekten bij de mens.

We hebben eerder aangetoond dat transgene muizen die vesiculaire glutamaat transporter 3 (VGLUT3) geboren doof door gebrek aan glutamaat afgifte aan de IHC lint synaps ^25. Omdat deze mutatie niet leidt tot een primaire degeneratie van sensorische haarcellen, deze mutante muizen potentieel een uitstekend model waarin cochleaire gentherapie voor aangeboren gehoorverlies testen.

Tot op heden zijn een aantal virale toedieningstechnieken voor cochleaire gentherapie beschreven, waaronder ronde venster membraan diffusie, ronde venster membraan injectie en levering via cochleostomie. Er zijn krachtigeial en nadelen van elk van deze benaderingen ^9.

Hier beschrijven we een chirurgische methode voor het viraal gemedieerde gen levering aan de VGLUT3 KO muis binnenoor door het ronde venster membraan (RWM). De post-auriculaire RWM injectie methode is minimaal invasieve met een uitstekend gehoor behoud, en is relatief snel. Zoals wij eerder hebben gepubliceerd, in een poging te herstellen horen in dit muismodel, een AAV1 vector die het gen VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) werd in de cochlea van deze dove muizen bij postnatale dag 12 (P! @), Waardoor het herstel van het gehoor ^26. Hoorzitting in de VGLUT3 KO muizen werd geverifieerd door auditieve hersenstam respons (ABR), terwijl transgene eiwitexpressie werd gecontroleerd met behulp van immunofluorescentie (IF). Deze methode toont hiermee aan dat viraal-gemedieerde gentherapie een genetisch defect dat anders zou resulteert in doofheid kan corrigeren.

Protocol

OPMERKING: Alle procedures en dierlijke behandeling nageleefd NIH ethische richtlijnen en goedgekeurd protocol eisen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Californië, San Francisco. 1. Voorbereiding van de Animal voor Heelkunde Het uitvoeren van chirurgische ingrepen in een schone, gewijd ruimte. Autoclaaf alle chirurgische instrumenten steriliseren met een glazen kraal sterilisator vóór de ingreep. OPMERKING: In dit protocol gebruike…

Representative Results

Om de technische kenmerken en het nut van de post-auriculaire benadering voor cochleaire moleculaire therapie te controleren werden AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP en AAV2-GFP in P10-12 muizen binnenoor geleverd via de RWM. Deze benadering houdt echter succesvol transgenexpressie binnen binnenste haarcellen (IHC) (VGLUT3 Figuur 1 en Figuur 2 GFP en GFP figuur 3A), buitenste haarcellen (OHC) (GFP figuur 2) en steuncellen (GFP Figuur 2 en F…

Discussion

In dit werk hebben we in detail een techniek die kan worden gebruikt voor cochleaire gentherapie met als doel het herstellen of reddings- normale gehoorfunctie die gecompromitteerd door een genetisch defect. Aangezien het typisch atraumatische, deze benadering is veilig voor cochleaire gentransfer of andere potentiële moleculaire therapieën ^30. Andere benaderingen voor cochleaire therapie zijn beschreven, waaronder een ventrale benadering ^24, cochleostomie ^31,32 en endolymfatische zak …

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Butler Schein
Xylazine	AnaSed
Acepromazine	Provided by UCSF LARC
Carprofen analgesia	Provided by UCSF LARC
Betadine	Betadine Puredue Pharma
dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex)	Alcon
Heating pad	Braintree scientific, inc.
25G needle	BD	305127
Borosilicate capillary pipette	World precision instruments, inc.	1B100F-4
Suture PDS*plus Antibacterial	Ethicon	PDP149
Tissue glue (Vetcode)	Butler Schein	31477
Rabbit Anti-GFP antibody	Invitrogen	A11122
Dissecting microscope	Leica		MZ95
Flaming/ Brown Micropipette	Sutter Instrument Co
Puller Model P-97
TDT BioSig III System	Tucker-Davis Technologies