Méthode chirurgicale pour Virally Mediated Gene livraison à l'oreille de la souris intérieure à travers la membrane de fenêtre ronde

Summary

The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.

Abstract

La thérapie génique, utilisé pour réaliser la récupération fonctionnelle de surdité neurosensorielle, promet d'accorder une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et génétiques sous-jacents qui contribuent à la perte d'audition. Introduction de vecteurs dans l'oreille interne doit être fait d'une manière qui distribue largement l'agent tout au long de la cochlée, tout en minimisant les blessures aux structures existantes. Ce manuscrit décrit une approche chirurgicale post-auriculaire qui peut être utilisé pour la thérapie cochléaire de la souris en utilisant moléculaire, pharmacologique, et la livraison virale à des souris de jour postnatal 10 ans et plus par l'intermédiaire de la membrane de la fenêtre ronde (MLE). Cette approche chirurgicale permet la livraison rapide et directe dans la rampe tympanique tout en minimisant la perte de sang et d'éviter la mortalité animale. Cette technique consiste négligeable ou pas de dommages aux structures essentielles de l'oreille interne et moyenne ainsi que les muscles du cou tout en préservant totalement audience. Pour démontrer l'efficacité de cette technique chirurgicale, la glutam vésiculairetransporteur mangé trois KO (VGLUT3 KO) chez la souris sera utilisé comme un exemple d'un modèle de souris de la surdité congénitale qui récupère entendu après la livraison de VGLUT3 à l'oreille interne en utilisant un virus adéno-associé (AAV-1).

Introduction

La thérapie génique a longtemps été suggérée comme un traitement potentiel pour la perte auditive génétique, mais le succès dans ce domaine est resté inaccessible ^1. À ce jour, les méthodologies viralement médiation ont prédominé en raison de la capacité théorique de cibler des types cellulaires spécifiques dans la cochlée relativement inaccessible. Les deux adénovirus (AV) et le virus adéno-associé (AAV) ont été utilisés pour la livraison de gènes cochléaire. AAV sont avantageux dans la cochlée d'un certain nombre de raisons. Ils sont des virus à réplication déficiente et peuvent transférer efficacement molécules transgéniques pour différents types de cellules, y compris les neurones, une cible importante pour un certain nombre de causes de la perte auditive. AAV entrée dans la cellule est médiée par des récepteurs spécifiques ^2; Ainsi, le choix d'un serotype particulier doit être compatible avec les types de cellules à une transduction. AAV peut effectivement transfection de cellules de cheveux ³ et intégrer dans le génome de l'hôte, entraînant stable, expression à long terme de la transgenic protéines et le changement phénotypique dans la cellule ^4. Bien que pas nécessairement avantageux pour des applications à court terme tels que la régénération des cheveux-cellulaire, l'expression à long terme est très important pour le sauvetage stable de défauts génétiques. Parce que les AAV ne sont pas associés à une maladie humaine ou l'infection et ne démontrent aucune ototoxicité ^5,6,7, ils sont un candidat idéal pour une utilisation en thérapie génique pour les formes héréditaires de perte ^{de 8} entendre.

Transfert de matériel génétique exogène dans l'oreille interne des mammifères en utilisant des vecteurs viraux a été étudié au cours de la dernière décennie et est en train de devenir une technique prometteuse pour le traitement des formes à la fois génétiques et acquis de la perte auditive ^neuf. La cochlée est potentiellement une cible idéale pour la thérapie génique pour plusieurs raisons: 1) son petit volume nécessite un nombre limité de virus nécessaire; 2) son isolement relatif des autres effets des limites des systèmes d'organes secondaires; et 3) les chambres remplies de liquide faciliter viraleenvoi dans toute le labyrinthe ^{10, 11,12,13,14, 15.}

Des modèles murins de la surdité congénitale permettent une utilisation de plusieurs méthodes d'étude pour suivre le développement de l'oreille interne d'une manière reproductible systématique. Alors que la petite taille de cochlée de souris ne présente une certaine difficulté chirurgicale, la souris sert un modèle extrêmement important dans l'étude de la perte auditive génétique, avec plusieurs avantages expérimentaux sur les autres espèces ^16. Des modèles de souris permettent d'évaluer un éventail de caractéristiques à travers l'analyse de liaison génétique, la collecte d'observations morphologiques détaillées, et la simulation de scénarios pathogènes; en tant que tels, ils sont de bons candidats pour la thérapie génique à médiation virale. De vastes études génétiques chez les souris combinées avec les avancées technologiques ont permis de générer des souris génétiquement modifiées de façon reproductible dans les laboratoires ^{17,18, 19, 20,21.} AILLEURSe, il existe de nombreux modèles à la fois pour acquises et héréditaires auditives phénotypes de perte chez la souris, ce qui permet des tests rigoureux dans ce modèle animal ^{22, 23,24.} Ainsi, la correction auditive en utilisant la thérapie génique virale médiation dans un modèle de souris est une première étape appropriée dans la recherche d'un remède pour la maladie humaine.

Nous avons précédemment montré que les souris transgéniques dépourvues de glutamate transporteur vésiculaire 3 (VGLUT3) naissent sourds en raison du manque de la libération de glutamate à l'IHC ruban synapse ^25. Étant donné que cette mutation ne conduit pas à une dégénérescence primaire des cellules ciliées sensorielles, ces souris mutantes sont potentiellement un excellent modèle pour tester dans laquelle la thérapie génique pour cochléaire surdité congénitale.

A ce jour, un certain nombre de techniques de délivrance viraux pour la thérapie génique cochléaire ont été décrites, y compris autour de diffusion de la membrane de fenêtre, l'injection de la membrane de fenêtre ronde et la livraison via une cochléostomie. Il ya puissanteial avantages et les inconvénients de chacune de ces approches ^neuf.

Nous rapportons ici une méthode chirurgicale pour la livraison de gènes à médiation virale de l'oreille interne VGLUT3 KO souris à travers la membrane de la fenêtre ronde (MLE). La méthode d'injection RWM post-auriculaire est peu invasive avec une excellente conservation de l'audience, et est relativement rapide. Comme nous l'avons déjà publié, dans un effort pour restaurer l'audition dans ce modèle de souris, un vecteur AAV1 portant le gène de VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) a été introduit dans la cochlée de ces souris sourds au jour postnatal 12 (P! @), Résultant en la restauration de l'audition ^26. Audience chez les souris KO VGLUT3 a été vérifiée par la réponse du tronc cérébral (ABR), tandis que l'expression de la protéine transgénique a été vérifiée par immunofluorescence (IF). Cette méthodologie démontre ainsi que la thérapie génique à médiation virale peut corriger un défaut génétique qui serait sinon résultats de la surdité.

Protocol

NOTE: Toutes les procédures et la manipulation des animaux respecté les lignes directrices en matière d'éthique du NIH et exigences du protocole approuvées du soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de Californie, San Francisco. 1. Préparation de l'animal pour la chirurgie Effectuer des procédures chirurgicales dans un espace propre dédié. Autoclave tous les instruments de chirurgie, stériliser avec un stérilisateur…

Representative Results

Pour vérifier les caractéristiques techniques et l'utilité de l'approche post-auriculaire pour la thérapie moléculaire cochléaire, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP et AAV2-GFP ont été livrés à des souris P10-12 oreille interne via le MLE. Cette approche démontre l'expression du transgène avec succès dans les cellules ciliées internes (IHC) (VGLUT3 Figure 1 et la GFP Figure 2 et la GFP figure 3A), les cellules ciliées externes (CCE) (GFP Figure 2)…

Discussion

Dans ce travail, nous décrivons en détail une technique qui peut être utilisé pour la thérapie génique cochléaire, dans le but de rétablir ou sauvetage fonction auditive normale qui est compromise par un défaut génétique. Comme il est généralement atraumatique, cette approche est sans danger pour le transfert de gènes cochléaire ou d'autres thérapies moléculaires potentielles ^30. D'autres approches pour la thérapie cochléaire ont été décrits, y compris une approche ventrale ^…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Butler Schein
Xylazine	AnaSed
Acepromazine	Provided by UCSF LARC
Carprofen analgesia	Provided by UCSF LARC
Betadine	Betadine Puredue Pharma
dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex)	Alcon
Heating pad	Braintree scientific, inc.
25G needle	BD	305127
Borosilicate capillary pipette	World precision instruments, inc.	1B100F-4
Suture PDS*plus Antibacterial	Ethicon	PDP149
Tissue glue (Vetcode)	Butler Schein	31477
Rabbit Anti-GFP antibody	Invitrogen	A11122
Dissecting microscope	Leica		MZ95
Flaming/ Brown Micropipette	Sutter Instrument Co
Puller Model P-97
TDT BioSig III System	Tucker-Davis Technologies