Détection et analyse de l'ADN dommages souris muscle squelettique In Situ Utilisation de la méthode TUNEL

Résumé

Cette vidéo décrit la dissection, le traitement des tissus, le sectionnement et le marquage TUNEL par fluorescence du muscle squelettique de la souris. Il décrit également une méthode d’analyse semi-automatisée de l’étiquetage TUNEL.

Résumé

Le marquage final de la désoxynucléotidyl transférase (TdT) et de la désoxyuridine triphosphate (dUTP) (TUNEL) est la méthode d’utilisation de l’enzyme TdT pour attacher de manière covalente une forme marquée de dUTP aux extrémités 3' des cassures d’ADN double et simple brin dans les cellules. Il s’agit d’une méthode fiable et utile pour détecter les dommages à l’ADN et la mort cellulaire in situ. Cette vidéo décrit la dissection, le traitement des tissus, le sectionnement et le marquage TUNEL basé sur la fluorescence du muscle squelettique de la souris. Il décrit également une méthode de quantification semi-automatisée du signal TUNEL. Les caractéristiques normales inhérentes des tissus et les conditions de traitement des tissus affectent la capacité de l’enzyme TdT à marquer efficacement l’ADN. Le traitement des tissus peut également ajouter une autofluorescence indésirable qui interférera avec la détection du signal TUNEL. Par conséquent, il est important de déterminer empiriquement les méthodes de traitement des tissus et de marquage TUNEL qui permettront d’obtenir le rapport signal/bruit optimal pour la quantification ultérieure. Le test basé sur la fluorescence décrit ici fournit un moyen d’exclure le signal autofluorescent par soustraction de canal numérique. Le test TUNEL, utilisé avec des techniques et des contrôles appropriés de traitement des tissus, est une méthode quantitative relativement rapide et reproductible pour détecter l’apoptose dans les tissus. Il peut être utilisé pour confirmer les dommages à l’ADN et l’apoptose en tant que mécanismes pathologiques, pour identifier les types de cellules affectées et pour évaluer l’efficacité des traitements thérapeutiques in vivo.

Introduction

Désoxynucléotidyl transférase (TdT) dUTP nick Terminal étiquetage final (TUNEL) est le processus d'utilisation de l'enzyme TdT pour fixer dUTP à 3 'extrémités de double et l'ADN simple brin casse ^12,23. La méthode TUNEL pour la détection de l'apoptose et dommages à l'ADN a été signalée il ya plus de 20 ans par Gavrieli et al. ^1,12,24. Depuis, il a été évalué et optimisé dans les différentes préparations de tissu ^7,23,27,40. TUNEL a été utilisée pour étudier la mort cellulaire induite par l'ischémie des neurones et des cardiomyocytes ^{43,44 6,14,29,} excitotoxique mort des cellules neuronal....

Protocole

NOTE: Toutes les procédures d'animaux décrits dans le présent protocole ont été réalisées en conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health ^26. Le protocole (MO13M391) a été approuvé par le Comité Université soin et l'utilisation des animaux Johns Hopkins.

Sacrifice 1. néonatale souris, Dissection, et fixation

1. Sacrifiez une souris néonatale par inhalation de CO _2.
2. Immédiatement couper la patte arrière au-dessus du genou. Jusqu'au jour environ 7 postnatale, les os de la jambe sont asse....

Résultats

Avec coloration réussie, signal de TUNEL positif doit être assez brillant pour isoler autofluorescence en fixant des seuils d'intensité. Objets TUNEL-positives à faible grossissement peuvent apparaître fragments irréguliers brillants dans le muscle squelettique (Figure 1A). Toutefois, à plus fort grossissement, certains objets TUNEL positif avec la morphologie apoptotique classique doivent être respectées, si le type de mort cellulaire impliquée est l'apoptose (figure 1B). Le contrôle p.......

Discussion

Une méthode pour détecter et analyser quantitativement dommages à l'ADN associée apoptose dans le muscle squelettique de souris est décrit. La procédure comprend la récolte des tissus, coloration TUNEL, l'acquisition d'image numérique, et l'analyse d'image. Fournitures et des outils histologiques communes sont nécessaires, et un kit spécial commerciale TUNEL est nécessaire. Les grands éléments essentiels de l'équipement nécessaires sont un cryostat, un microscope à épifluorescence avec une capaci.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
4 % Paraformaldéhyde dans une solution saline tamponnée au phosphate	Microscopie électronique Sciences	19202	Pour les procédures décrites ici, une solution à 4 % a été préparée fraîche à partir de poudre. Le paraformaldéhyde de n’importe quel fournisseur peut être utilisé. La solution de formaldéhyde préparée doit être conservée à 4 ° ; C et ne doit pas être utilisé après sa date de péremption (jusqu’à plusieurs mois). Le paraformaldéhyde est un cancérigène et une toxine par inhalation et par contact avec la peau. Veuillez suivre les précautions spécifiées dans la fiche signalétique lors de la manipulation du paraformaldéhyde.
Saccharose	Sigma	S0389	Utilisé pour la cryoprotection des tissus avant la congélation. Le saccharose de n’importe quel fournisseur peut être utilisé.
Composé O.C.T.	Tissue-Tek	4583	Milieu d’enrobage pour la cryosection.
Cryostat	Leica	CM 3050S	Un cryostat Leica CM3050S a été utilisé pour les préparations décrites ici. Tout cryostat capable de couper 10 &mu ; Des sections M peuvent être utilisées.
Diapositives en verre, 25 x 75 x 1 mm	Fisher	12-552-3	Des diapositives de n’importe quel fournisseur peuvent être utilisées.
Gélatine	Sigma	G-9391	La gélatine est utilisée pour favoriser l’adhérence des sections tissulaires aux lames de verre. Pour enduire les lames de verre de gélatine, dissoudre 2,75 g de gélatine et 0,275 g d’alun chromé dans 500 ml d’eau distillée, tiède à 60 °C C, trempez les lames pendant plusieurs secondes et laissez sécher. La gélatine de n’importe quel fournisseur peut être utilisée. Des lames pré-revêtues de gélatine peuvent également être achetées.
Sulfate de potassium de chrome (III) dodécahydrate (alun de chrome)	Sigma	243361	L’alun de chrome est ajouté à une solution de gélatine pour favoriser l’adhérence tissulaire sur les lames de verre. C’est un cancérogène possible et une toxine par inhalation et contact cutané. Veuillez suivre les précautions spécifiées dans la fiche signalétique lors de la manipulation de l’alun chromé.
Réactif d’adhérence tissulaire Vectabond	Vector Labs	SP-1800	Substrat en option pour une meilleure adhérence tissulaire aux lames de verre ; des lames recouvertes de gélatine peuvent être utilisées à la place.
Tween20	Sigma	P9416	Un détergent utilisé pour perméabiliser les tissus. Tween20 de n’importe quel fournisseur peut être utilisé.
Triton X100	Sigma	T8787	Un détergent utilisé pour perméabiliser les tissus. Triton X100 de n’importe quel fournisseur peut être utilisé.
TACS 2 TdT fluorescéine in situ kit de détection de l’apoptose	Trevigen	4812-30-K	Kit commercial pour le marquage TUNEL basé sur la fluorescence.
DNase/nucléase	Trevigen	4812-30-K	(inclus avec le kit)
DNase/nucléase	tampon Trevigen	4812-30-K	(inclus avec le kit)
10x solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4	Amresco	780	Make 1x PBS pour les lavages et les dilutions. Les PBS de n’importe quel fournisseur peuvent être utilisés.
Eau sans DNase	Qualité Produits biologiques	351-029-131	L’eau de n’importe quel fournisseur peut être utilisée.
Hoechst 33258	Sigma	94403	Colorant nucléaire. Tout colorant nucléaire fluorescent bleu peut être utilisé. En tant que colorant de liaison à l’ADN, Hoechst est un cancérogène suspecté et doit être manipulé avec un équipement de protection pour minimiser le contact avec la peau.
Parafilm M multiple		807	Tout autre film hydrophobe ou lamelle de recouvrement peut être utilisé. Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.
Microscope fluorescent avec appareil photo numérique	;--	;--	Tout microscope fluorescent capable de capturer numériquement la fluorescence rouge, verte et bleue dans des canaux séparés peut être utilisé.
Les supports anti-fondu Vectashield	Vector Labs	H-1000	peuvent être utilisés auprès de n’importe quel fournisseur.
lamelles en verre, épaisseur n° 1	Brain Research Labs	2222-1	Des lamelles de protection de n’importe quel fournisseur peuvent être utilisées. La plus petite taille de 22 x 22 mm est suffisante pour les sections de pattes de souris néonatales.
Vernis à ongles	Ted Pella	114-8	Utilisé pour sceller les lamelles. Il est possible d’utiliser du vernis à ongles de n’importe quel fournisseur (y compris les détaillants habituels). Évitez d’utiliser du vernis à ongles avec de la couleur ou des additifs qui peuvent refléter la lumière pendant l’imagerie fluorescente.