Neuromuscular צומת: גודל סינפסה מדידה, שינויי פיצול ובצפיפות חלבון Synaptic שימוש Confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי
Summary
The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.
Abstract
הצומת העצבית-שהרירית (NMJ) היא סינפסה הגדולה, כולינרגית הממסר שדרכו הנוירונים מוטוריים יונקים לשלוט התכווצות שרירים מרצון. שינויים מבניים בNMJ יכולים לגרום לכישלון עצבית, וכתוצאה מכך חולשה, ניוון ואף למוות של סיבי השריר. מחקרים רבים בחנו כיצד שינויים או מחלה גנטיים יכולים לשנות את המבנה של NMJ העכבר. למרבה הצער, זה יכול להיות קשה כדי להשוות ישירות ממצאים ממחקרים אלה כי לעתים קרובות הם מועסקים פרמטרים שונים ושיטות אנליטיות. שלושה פרוטוקולים מתוארים כאן. הראשון משתמש בתמונות confocal הקרנת עוצמה מקסימלית כדי למדוד את השטח של קולטן האצטילכולין (AChR) -rich תחומים קרום postsynaptic בendplate והאזור של מכתים שלפוחית הסינפטית במסוף עצב presynaptic שמעליה. הפרוטוקול השני משווה את העוצמות היחסית של immunostaining לחלבונים סינפטיים בקרום postsynaptic. יחסי הציבור השלישיotocol משתמש העברת הקרינה תהודה אנרגיה (סריג) כדי לזהות שינויים באריזה של AChRs postsynaptic בendplate. הפרוטוקולים פותחו ושוכללו על סדרה של מחקרים. גורמים המשפיעים על האיכות ועקביות של תוצאות נדונים ונתונים נורמטיביים מסופקים NMJs בעכברים צעירים למבוגרים בריאים.
Introduction
הצומת העצבית-שהרירית (NMJ) היא סינפסה הממסר הקריטית שמתווכת תקשורת בין מערכת העצבים ושרירי שלד. היא נדרשת לכל התנועה רצונית. מיקרוסקופ פלואורסצנטי משמש כבר זמן רב כדי לחקור את ההשפעות של transgenes על העכבר NMJ 1-3 או להשוות את ההשפעות של גיל, תזונה, פעילות גופנית ומחלות על NMJs מכרסמים 4-11. מחקרים מסוג זה לימדו אותנו הרבה על הפיסיולוגיה ופתופיזיולוגיה של NMJ, אבל הפרמטרים המגוונים דיווחו (למשל, אזור AChR, אזור endplate, אורך היקפי, מדדי פיצול) לעתים קרובות לעשות את זה קשה להשוות את הממצאים של מחקרים אלה. יש ציפייה גוברת לחוקרים פרה-קליניים כדי להיות מסוגלים להפגין שחזור, במיוחד במחקרים עם מודלים של מכרסמים של מחלה 12. הפרוטוקולים שתוארו כאן היו מעודנים באמצעות סדרה של מחקרים שחקרה ch התפתחותית, פיסיולוגי וpathophysiologicalAnges לNMJ. מחקרים מסוג זה דורשים מדידה של השטח של התמחויות הסינפטי בendplate מנוע עכבר והצפיפות היחסית של אריזה של חלבונים סינפטיים בתוך התמחויות postsynaptic 13-15.
השירות של שיטות אלה בא לידי ביטוי במחקרים שנעשה לאחרונה במודל של עכברים של אנטי-מושק מיאסטניה גרביס. זריקות יומיות של IgG ממיאסטניה אנטי-מושק חיובית גרביס חולים לעכברים בוגרים שנגרמו להם להיות חלשים בתוך 2 שבועות 16. תמונות מרבי הקרנת Confocal סעיפים שריר שכפול שכותרתו עבור synaptophysin (בעצבי מסופים) וAChRs postsynaptic הציגו ירידה הדרגתית באזור של מכתים AChR כשינוי היסודי. חשוב לציין את קצב הירידה היה די כדי להסביר ירידות דומות במשרעת של פוטנציאלים סינפטיים, כישלון של העברת הסינפטית וחולשת השרירים 17,18. איכותי ממצאים דומים דווחו על ידי קבוצות מחקר אחרות10,19. באותן שיטות מדידת NMJ ומאז נהגו להעריך את ההשפעה של שלוש תרופות לטיפול במיאסטניה גרביס אנטי-המושק ב20,21 מודל העכבר הזה.
הזדקנות כרוך בישיבה יכולה להוביל לאובדן של קשרים עצביים-שרירית. הפרוטוקולים שתוארו כאן חשפו ירידת גיל הקשורים בתחום synaptophysin מסוף העצב בendplates המוטורי כמו עכברים להתקדם בגיל מבוגר. באותן השיטות גילו כי פעילות גופנית במידה רבה מרצון יכולה למנוע את הירידה בשטח מסוף עצב presynaptic 22, עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים על ידי קבוצות אחרות 4. אובדן של קשרים עצביים-שרירית מתרחש גם במודל עכבר SOD1G93A של טרשת לרוחב amyotrophic 9,23.
המחקרים שהוזכרו לעיל מראים כי מגוון רחב של מצבים בריאותיים עלול להוביל לירידה בשטח של שני התמחויות לפני או אחרי-סינפטי בNMJ. הדבר עלול לגרום כיף הסינפטי לקויction או עשוי לבשר אובדן הקשר העצבי-שהרירית מלא. שלושה פרוטוקולים מתוארים המאפשרים לכמת את האזור והצפיפות של התמחויות הסינפטי. המטרה של הפרוטוקול הראשון היא לספק מידה מעשית ושחזור של התחומים לפני והתמחויות פוסט-סינפטי ויישורם בNMJs היונקים, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תמונות דו-ממדיות המרביות confocal ההקרנה וניתוח תמונה עם NIH ImageJ משמש כדי לזהות שינויים באזור של מכתים synaptophysin (שלפוחית סינפטית), AChRs postsynaptic ואזור חפיפה הסינפטי. פרמטרים Confocal הדמיה (רווח לקזז רמה) מותאמים לכל NMJ על מנת למקסם את המידע החזותי המשמש להבחין תחום התמחות הסינפטי. כישלון Neuromuscular יכול לנבוע גם משינויים בצפיפות של AChR postsynaptic ו / או חלבונים סינפטיים אחרים. הפרוטוקול השני ניתן ליישם כדי לזהות שינויים בצפיפות היחסית של חלבוני postsynaptic כזהכמושק, rapsyn, dystroglycan, קינאז Src phosphorylated וAChR phosphorylated 18,21.
במיאסטניה גרביס, צפיפות מופחתת של AChR בתוך הקרום postsynaptic היא הגורם המיידי לכישלון הסינפטי וחולשת שרירים. הפרוטוקול השלישי מתאר שיטת העברת הקרינה תהודה אנרגיה (סריג) כדי להעריך את השינויים בקרבת AChRs הסמוך בתוך ממברנות postsynaptic 14,15. שיטה זו מזהה העברת אנרגיה בין AChRs השכן שכותרתו עם הניאון-α-bungarotoxin (BGT). סריג מתרחש רק כאשר בדיקות תורם acceptor ניאון בנפרד פחות מ -10 ננומטר. זה יכול לגלות שינויים (תת-מיקרוסקופים) באטימות של אריזת AChR שעשוי להיות קשור ישירות להמשרעת של פוטנציאל הסינפטי.
שלושת פרוטוקולים אלה, מעודנים בעשור האחרון, מספקים אמצעי משלימים של יושרת NMJ באופן עקבי לשחזור. שימוש בפרוטוקולים סטנדרטייםפרמטרים nd צריכים לאפשר השוואה של ההשפעות של גנים והתערבויות סביבתיות על NMJ של היונקים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקולים שתוארו כאן, אפשרו לנו למדוד באופן מהימן ולכמת שינויים במאפיינים של NMJ על פני מגוון מצבים, כולל מדינות הזדקנות ומחלות נורמליות. השיטות שתוארו עבור en פנים תמונות NMJ תאפשר לחוקרים להשוות את השטח של התמחויות טרום postsynaptic ואזור חפיפה / יישור הסינפטי. כדי להשוות ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the National Health and Medical Research Council [570930]. Imaging was carried out at the Bosch Institute Advanced Microscopy Facility. Former members of the lab, whose work is cited, are thanked for their contributions to developing these methods.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Scanning confocal microscope | Leica | DM IRE2 with TCS SP2 system | Most scanning confocal microscopes should be suitable. |
| Zeiss | LSM 510 Meta | ||
| Leica | SPE-II | ||
| Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT) | Life technologies | B35451 | Used for labelling AChRs |
| Alexa647-α-bungarotoxin (far-red-BGT) | Life technologies | B35450 | Far red fluorescence: barely visible through the eyepiece |
| rabbit anti-synaptophysin | Life technologies | 18-0130 | Different batches of primary antibody differ in effective working dilution |
| FITC-anti-rapsyn mab1234 | Milipore | FCMAB134F | Monoclonal antibody conjugated to FITC |
| FITC-donkey anti-rabbit IgG | Jackson | 711-095-152 | Polyclonal secondary antibodies can vary in quality according to source and batch |
| Optimal Cutting Temperature compound (O.T.C.) | ProSciTech | IA018 | Cryostat embedding matrix for freezing muscles |
| DABCO | Sigma | 10981 | Mounting medium that slows photobleaching of fluorophors |
References
- Schmidt, N., et al. Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of α-dystrobrevin. J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).
- Amenta, A. R., et al. Biglycan is an extracellular MuSK binding protein important for synapse stability. J Neurosci. 32, 2324-2334 (2012).
- Samuel, M. A., Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Agrin and Synaptic Laminin Are Required to Maintain Adult Neuromuscular Junctions. PLOS ONE. 7, e46663 (2012).
- Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proc Natl Acad Sci (USA). 107, 14863-14868 (2010).
- Yampolsky, P., Pacifici, P. G., Witzemann, V. Differential muscle-driven synaptic remodeling in the neuromuscular junction after denervation). Eur J Neurosci. 31, 646-658 (2010).
- Li, Y., Lee, Y., Thompson, W. J. Changes in Aging Mouse Neuromuscular Junctions Are Explained by Degeneration and Regeneration of Muscle Fiber Segments at the Synapse. J Neurosci. 31, 14910-14919 (2011).
- Zhu, H., Bhattacharyya, B. J., Lin, H., Gomez, C. M. Skeletal muscle IP3R1 receptors amplify physiological and pathological synaptic calcium signals. J Neurosci. 31, 15269-15283 (2011).
- Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles. PLoS ONE. 7, e34640 (2012).
- Perez-Garcia, M. J., Burden, S. J. Increasing MuSK Activity Delays Denervation and Improves Motor Function in ALS Mice. Cell reports. 2, 1-6 (2012).
- Klooster, R., et al. Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice. Brain. 135, 1081-1101 (2012).
- Pratt, S. J., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591, 559-570 (2013).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
- Gervásio, O. L., Phillips, W. D. Increased ratio of rapsyn to ACh receptor stabilizes postsynaptic receptors at the mouse neuromuscular synapse. J Physiol. 562, 673-685 (2005).
- Gervásio, O. L., Armson, P. F., Phillips, W. D. Developmental increase in the amount of rapsyn per acetylcholine receptor promotes postsynaptic receptor packing and stability. Dev Biol. 305, 262-275 (2007).
- Brockhausen, J., Cole, R. N., Gervásio, O. L., Ngo, S. T., Noakes, P. G., Phillips, W. D. Neural agrin increases postsynaptic ACh receptor packing by elevating rapsyn protein at the mouse neuromuscular synapse. Dev Neurobiol. 68, 1153-1169 (2008).
- Cole, R. N., Reddel, S. W., Gervásio, O. L., Phillips, W. D. Anti-MuSK patient antibodies disrupt the mouse neuromuscular junction. Ann Neurol. 63, 782-789 (2008).
- Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. Muscle Specific Kinase autoantibodies cause synaptic failure through progressive wastage of postsynaptic acetylcholine receptors. Exp Neurol. 237, 237-286 (2012).
- Cole, R. N., Ghazanfari, N., Ngo, S. T., Gervasio, O. L., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Patient autoantibodies deplete postsynaptic Muscle Specific Kinase leading to disassembly of the ACh receptor scaffold and myasthenia gravis in mice. J Physiol. 588, 3217-3229 (2010).
- Viegas, S., et al. Passive and active immunization models of MuSK-Ab positive myasthenia: Electrophysiological evidence for pre and postsynaptic defects. Exp Neurol. 234, 506-512 (2012).
- Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. Pyridostigmine but not 3,4-diaminopyridine exacerbates ACh receptor loss and myasthenia induced in mice by Muscle Specific Kinase autoantibody. J Physiol. 591, 2747-2762 (2013).
- Ghazanfari, N., Morsch, M., Reddel, S. W., Liang, S. X., Phillips, W. D. Muscle Specific Kinase autoantibodies suppress the MuSK pathway and ACh receptor retention at the mouse neuromuscular junction. J Physiol. 592, 2881-2897 (2014).
- Cheng, A., Morsch, M., Murata, Y., Ghazanfari, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Sequence of age-associated changes to the mouse neuromuscular junction and the protective effects of voluntary exercise. PLoS One. 8, e67970 (2013).
- Schaefer, A. M., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. A compensatory subpopulation of motor neurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Comp Neurol. 490, 209-219 (2005).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLos Biol. 8, e1000412 (2010).
- Shimizu, S., Hedrich, H. J., Bullock, G. Routes of Administration. The Laboratory Mouse. , (2004).
- Chiasson, R. B. . Laboratory anatomy of the white rat. , (1988).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Mitra, A. K., Stroud McCarthy, M. P., M, R. Three-dimensional structure of the nicotinic acetylcholine receptor and location of the major associated 43-kD cytoskeletal protein, determined at 22A by low dose electron microscopy and x-ray diffraction to 12.5A. J Cell Biol. 109, 755-774 (1989).
- Paas, Y., et al. Electron microscopic evidence for nucleation and growth of 3D acetylcholine receptor microcrystals in structured lipid-detergent matrices. Proc. Natl Acad. Sci. (USA). 100, 11309-11314 (2003).
- Samson, A. O., Scherf, T., Eisenstein, M., Chill, J. H., Anglister, J. The mechanism for acetylhcoline receptor inhibition by α-neurotoxins and species-specific resistance to α-bungarotoxin revealed by NMR). Neuron. 35, 319-332 (2002).
- Ghazanfari, N., et al. Muscle Specific Kinase: Organiser of synaptic membrane domains. Int J Biochem Cell Biol. 43, 295-298 (2011).
- Ghazanfari, N., Morsch, M., Tse, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Effects of the β2-adrenoceptor agonist, albuterol, in a mouse model of anti-MuSK myasthenia gravis. PLoS ONE. 9, e87840 (2014).
- Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. J Neurocytol. 25, 88-100 (1996).
- Salpeter, M. M., Harris, R. Distribution and turnover rate of acetylcholine receptors throughout the junction folds at a vertebrate neuromuscular junction. J Cell Biol. 96, 1781-1785 (1983).
- Soper, S. A., Nutter, H. L., Keller, R. A., Davis, L. M., Shera, E. B. The photophysical constants of several fluorescent dyes pertaining to ultrasensitive fluorescence spectroscopy. Photochem Photobiol. 57, 972-977 (1993).
- Panchuk-Voloshina, N., et al. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).
