على الموصل العصبي العضلي: قياس المشبك الحجم، التغييرات تجزئة ومتشابك الكثافة البروتين عن طريق متحد البؤر مضان المجهر
Summary
The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.
Abstract
الوصل العصبي العضلي (NMJ) هو كبير، والتتابع الكوليني المشبك من خلالها الخلايا العصبية الحركية الثدييات تتحكم تقلص العضلات الطوعية. التغييرات الهيكلية في NMJ يمكن أن يؤدي إلى فشل العصبي، مما يؤدي إلى ضعف، وضمور وحتى الموت من الألياف العضلية. حققت العديد من الدراسات كيف تعديلات وراثية أو أمراض يمكن أن يغير هيكل NMJ الماوس. لسوء الحظ، يمكن أن يكون من الصعب مقارنة النتائج مباشرة من هذه الدراسات لأنها غالبا ما تستخدم معايير مختلفة وأساليب التحليلية. وصفت ثلاثة بروتوكولات هنا. أول يستخدم أقصى الإسقاط كثافة الصور مبائر لقياس مجال أستيل مستقبلات (الاستشاري لحقوق الإنسان) الغنية المجالات الغشاء بعد المشبكي في endplate ومنطقة متشابك حويصلة تلطيخ في المغطي الأعصاب الطرفية قبل المشبكي. بروتوكول الثاني يقارن كثافة نسبية للالمناعية للبروتينات متشابك في الغشاء بعد المشبكي. العلاقات العامة الثالثةotocol يستخدم نقل الإسفار الرنين الطاقة (الحنق) للكشف عن تغيرات في التعبئة من مركز عمان بعد المشبكي في endplate. وقد تم تطوير البروتوكولات وصقلها خلال سلسلة من الدراسات. وتناقش العوامل التي تؤثر على جودة واتساق النتائج ويتم توفير البيانات المعيارية للل NMJs في صحية الفئران الشباب البالغين.
Introduction
الوصل العصبي العضلي (NMJ) هو المشبك تتابع الأهمية بمكان أن يتوسط التواصل بين الجهاز العصبي والعضلات والهيكل العظمي. هو مطلوب منها لجميع الحركات الإرادية. منذ فترة طويلة تستخدم مضان المجهر لدراسة آثار الجينات المحورة على الماوس NMJ 1-3 أو لمقارنة آثار السن، والنظام الغذائي وممارسة الرياضة والمرض على لل NMJs القوارض 4-11. لقد علمتنا هذه الدراسات لنا الكثير عن علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية من NMJ، ولكن ذكرت المعلمات المتنوعة (على سبيل المثال، منطقة الاستشاري لحقوق الإنسان، منطقة endplate، وطول محيط، مؤشرات تجزئة) غالبا ما تجعل من الصعب مقارنة النتائج التي توصلت إليها هذه الدراسات. وهناك توقعات متزايدة للباحثين ما قبل السريرية لتكون قادرة على إثبات استنساخ، لا سيما في الدراسات مع نماذج القوارض من المرض 12. تم تنقيح البروتوكولات المذكورة هنا من خلال سلسلة من الدراسات التي حققت الفصل التنموي، الفسيولوجية والمرضية في جسم المريضفي نفس الفئة إلى NMJ. وتتطلب مثل هذه الدراسات قياس مجال التخصصات متشابك في endplate الماوس السيارات والكثافة النسبية من التعبئة والتغليف من البروتينات متشابك ضمن التخصصات بعد المشبكي 13-15.
وتتجلى فائدة هذه الأساليب التي كتبها الدراسات الحديثة في نموذج الفأر المضادة للالمسك الوهن العضلي الوبيل. حقن يومية من مفتش من الوهن العضلي مكافحة المسك إيجابية الوهن تسبب المرضى إلى فئران بالغة لهم أن يصبحوا ضعيفة في حدود 2 أسابيع 16. وكشفت الصور الأقصى الإسقاط مبائر من أقسام العضلات التي وصفت نقرا مزدوجا لsynaptophysin (في النهايات العصبية) ومركز عمان بعد المشبكي في الانخفاض التدريجي في مجال الاستشاري لحقوق الإنسان تلطيخ كما تغير الابتدائي. كان الأهم معدل الانخفاض كافية لشرح انخفاضات مماثلة في السعة من إمكانات متشابك، فشل انتقال متشابك وضعف العضلات 17،18. نوعيا تم الإبلاغ عن نتائج مماثلة من قبل مجموعات بحثية أخرى10،19. ومنذ ذلك الحين تم استخدام طرق القياس NMJ نفسها لتقييم تأثير ثلاثة عقاقير لعلاج مضاد للالمسك الوهن العضلي الوبيل في هذا النموذج الماوس 20،21.
الشيخوخة المستقرة يمكن أن يؤدي إلى فقدان الاتصالات العصبية والعضلية. وقد كشفت البروتوكولات الموصوفة هنا تراجع المرتبط بالعمر في مجال الأعصاب الطرفية synaptophysin في endplates السيارات مع تقدم الفئران في سن الشيخوخة. كشفت الأساليب نفسها التي يمكن أن يمنع ممارسة الطوعية إلى حد كبير في الحد من العصبية قبل المشبكي منطقة محطة 22، بما يتفق مع الأعمال السابقة من قبل مجموعات أخرى 4. فقدان اتصالات العصبية والعضلية يحدث أيضا في نموذج SOD1G93A الماوس من التصلب الجانبي الضموري 9،23.
وتظهر الدراسات المذكورة أعلاه أن مجموعة متنوعة من الظروف الصحية قد يؤدي إلى تخفيضات في مجال التخصصات إما قبل أو بعد متشابك في NMJ. هذا قد يؤدي إلى متعة متشابك ضعفction أو قد تبشر خسارة كاملة للاتصال العصبي العضلي. ووصف ثلاثة بروتوكولات الكميات التي تسمح للمنطقة وكثافة التخصصات متشابك. الغرض من البروتوكول الأول هو توفير قدر عملي وقابلة للتكرار للمناطق قبل والتخصصات ما بعد متشابك واتساقها في لل NMJs الثدييات، وذلك باستخدام المجهر مضان. يستخدم ثنائي الأبعاد القصوى الصور الإسقاط متحد البؤر وتحليل الصور مع المعاهد الوطنية للصحة يماغيج للكشف عن تغيرات في مجال synaptophysin تلطيخ (الحويصلات متشابك)، مركز عمان بعد المشبكي ومنطقة تداخل متشابك. هي الأمثل المعلمات مبائر التصوير (الربح وتعويض المستوى) لكل NMJ وذلك لتحقيق أقصى قدر من المعلومات البصرية تستخدم لتمييز مجال التخصص متشابك. يمكن فشل العصبي العضلي أيضا نتيجة من التغيرات في كثافة الاستشاري لحقوق الإنسان بعد المشبكي و / أو البروتينات متشابك الأخرى. ويمكن تطبيق البروتوكول الثاني للكشف عن تغيرات في الكثافة النسبية للبروتينات بعد المشبكي هذهكما المسك، rapsyn، dystroglycan، فسفرته SRC كيناز وفسفرته الاستشاري لحقوق الإنسان 18،21.
في الوهن العضلي الوبيل، كثافة انخفاض الاستشاري لحقوق الإنسان داخل الغشاء بعد المشبكي هي السبب المباشر لفشل متشابك وضعف العضلات. ويصف البروتوكول الثالث طريقة نقل الإسفار الرنين الطاقة (الحنق) لتقييم التغيرات في المناطق القريبة من مركز عمان المجاورة داخل الأغشية بعد المشبكي 14،15. هذه الطريقة بالكشف عن نقل الطاقة بين مركز عمان المجاورة المسمى مع فلوري-α-بنغاروتوكسين (BGT). الحنق يحدث فقط عندما يكون تحقيقات الفلورسنت المانحة ومتقبل أقل من 10 نانومتر إربا. هذا يمكن أن تكشف (دون المجهرية) التغيرات في ضيق من التعبئة الاستشاري لحقوق الإنسان التي قد تتصل مباشرة إلى السعة من إمكانات متشابك.
هذه البروتوكولات الثلاثة، والمكرر على مدى العقد الماضي، توفر تدابير تكميلية النزاهة NMJ بطريقة متسقة وقابلة للتكرار. استخدام بروتوكولات موحدة ليجب المعلمات ND تسهيل المقارنة بين تأثيرات الجينات والتدخلات البيئية على NMJ الثدييات.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد مكنت البروتوكولات الموصوفة هنا لنا لقياس بشكل موثوق وقياس التغيرات في خصائص NMJ عبر مجموعة من الشروط، بما في ذلك الشيخوخة والمرض الدول العادية. الطرق الموضحة للأون تواجه والصور NMJ تسمح للباحثين لمقارنة مجال التخصصات قبل وبعد المشبكي ومنطقة متشابك التداخل / المحاذ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the National Health and Medical Research Council [570930]. Imaging was carried out at the Bosch Institute Advanced Microscopy Facility. Former members of the lab, whose work is cited, are thanked for their contributions to developing these methods.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Scanning confocal microscope | Leica | DM IRE2 with TCS SP2 system | Most scanning confocal microscopes should be suitable. |
| Zeiss | LSM 510 Meta | ||
| Leica | SPE-II | ||
| Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT) | Life technologies | B35451 | Used for labelling AChRs |
| Alexa647-α-bungarotoxin (far-red-BGT) | Life technologies | B35450 | Far red fluorescence: barely visible through the eyepiece |
| rabbit anti-synaptophysin | Life technologies | 18-0130 | Different batches of primary antibody differ in effective working dilution |
| FITC-anti-rapsyn mab1234 | Milipore | FCMAB134F | Monoclonal antibody conjugated to FITC |
| FITC-donkey anti-rabbit IgG | Jackson | 711-095-152 | Polyclonal secondary antibodies can vary in quality according to source and batch |
| Optimal Cutting Temperature compound (O.T.C.) | ProSciTech | IA018 | Cryostat embedding matrix for freezing muscles |
| DABCO | Sigma | 10981 | Mounting medium that slows photobleaching of fluorophors |
References
- Schmidt, N., et al. Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of α-dystrobrevin. J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).
- Amenta, A. R., et al. Biglycan is an extracellular MuSK binding protein important for synapse stability. J Neurosci. 32, 2324-2334 (2012).
- Samuel, M. A., Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Agrin and Synaptic Laminin Are Required to Maintain Adult Neuromuscular Junctions. PLOS ONE. 7, e46663 (2012).
- Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proc Natl Acad Sci (USA). 107, 14863-14868 (2010).
- Yampolsky, P., Pacifici, P. G., Witzemann, V. Differential muscle-driven synaptic remodeling in the neuromuscular junction after denervation). Eur J Neurosci. 31, 646-658 (2010).
- Li, Y., Lee, Y., Thompson, W. J. Changes in Aging Mouse Neuromuscular Junctions Are Explained by Degeneration and Regeneration of Muscle Fiber Segments at the Synapse. J Neurosci. 31, 14910-14919 (2011).
- Zhu, H., Bhattacharyya, B. J., Lin, H., Gomez, C. M. Skeletal muscle IP3R1 receptors amplify physiological and pathological synaptic calcium signals. J Neurosci. 31, 15269-15283 (2011).
- Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles. PLoS ONE. 7, e34640 (2012).
- Perez-Garcia, M. J., Burden, S. J. Increasing MuSK Activity Delays Denervation and Improves Motor Function in ALS Mice. Cell reports. 2, 1-6 (2012).
- Klooster, R., et al. Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice. Brain. 135, 1081-1101 (2012).
- Pratt, S. J., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591, 559-570 (2013).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
- Gervásio, O. L., Phillips, W. D. Increased ratio of rapsyn to ACh receptor stabilizes postsynaptic receptors at the mouse neuromuscular synapse. J Physiol. 562, 673-685 (2005).
- Gervásio, O. L., Armson, P. F., Phillips, W. D. Developmental increase in the amount of rapsyn per acetylcholine receptor promotes postsynaptic receptor packing and stability. Dev Biol. 305, 262-275 (2007).
- Brockhausen, J., Cole, R. N., Gervásio, O. L., Ngo, S. T., Noakes, P. G., Phillips, W. D. Neural agrin increases postsynaptic ACh receptor packing by elevating rapsyn protein at the mouse neuromuscular synapse. Dev Neurobiol. 68, 1153-1169 (2008).
- Cole, R. N., Reddel, S. W., Gervásio, O. L., Phillips, W. D. Anti-MuSK patient antibodies disrupt the mouse neuromuscular junction. Ann Neurol. 63, 782-789 (2008).
- Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. Muscle Specific Kinase autoantibodies cause synaptic failure through progressive wastage of postsynaptic acetylcholine receptors. Exp Neurol. 237, 237-286 (2012).
- Cole, R. N., Ghazanfari, N., Ngo, S. T., Gervasio, O. L., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Patient autoantibodies deplete postsynaptic Muscle Specific Kinase leading to disassembly of the ACh receptor scaffold and myasthenia gravis in mice. J Physiol. 588, 3217-3229 (2010).
- Viegas, S., et al. Passive and active immunization models of MuSK-Ab positive myasthenia: Electrophysiological evidence for pre and postsynaptic defects. Exp Neurol. 234, 506-512 (2012).
- Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. Pyridostigmine but not 3,4-diaminopyridine exacerbates ACh receptor loss and myasthenia induced in mice by Muscle Specific Kinase autoantibody. J Physiol. 591, 2747-2762 (2013).
- Ghazanfari, N., Morsch, M., Reddel, S. W., Liang, S. X., Phillips, W. D. Muscle Specific Kinase autoantibodies suppress the MuSK pathway and ACh receptor retention at the mouse neuromuscular junction. J Physiol. 592, 2881-2897 (2014).
- Cheng, A., Morsch, M., Murata, Y., Ghazanfari, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Sequence of age-associated changes to the mouse neuromuscular junction and the protective effects of voluntary exercise. PLoS One. 8, e67970 (2013).
- Schaefer, A. M., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. A compensatory subpopulation of motor neurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Comp Neurol. 490, 209-219 (2005).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLos Biol. 8, e1000412 (2010).
- Shimizu, S., Hedrich, H. J., Bullock, G. Routes of Administration. The Laboratory Mouse. , (2004).
- Chiasson, R. B. . Laboratory anatomy of the white rat. , (1988).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Mitra, A. K., Stroud McCarthy, M. P., M, R. Three-dimensional structure of the nicotinic acetylcholine receptor and location of the major associated 43-kD cytoskeletal protein, determined at 22A by low dose electron microscopy and x-ray diffraction to 12.5A. J Cell Biol. 109, 755-774 (1989).
- Paas, Y., et al. Electron microscopic evidence for nucleation and growth of 3D acetylcholine receptor microcrystals in structured lipid-detergent matrices. Proc. Natl Acad. Sci. (USA). 100, 11309-11314 (2003).
- Samson, A. O., Scherf, T., Eisenstein, M., Chill, J. H., Anglister, J. The mechanism for acetylhcoline receptor inhibition by α-neurotoxins and species-specific resistance to α-bungarotoxin revealed by NMR). Neuron. 35, 319-332 (2002).
- Ghazanfari, N., et al. Muscle Specific Kinase: Organiser of synaptic membrane domains. Int J Biochem Cell Biol. 43, 295-298 (2011).
- Ghazanfari, N., Morsch, M., Tse, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Effects of the β2-adrenoceptor agonist, albuterol, in a mouse model of anti-MuSK myasthenia gravis. PLoS ONE. 9, e87840 (2014).
- Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. J Neurocytol. 25, 88-100 (1996).
- Salpeter, M. M., Harris, R. Distribution and turnover rate of acetylcholine receptors throughout the junction folds at a vertebrate neuromuscular junction. J Cell Biol. 96, 1781-1785 (1983).
- Soper, S. A., Nutter, H. L., Keller, R. A., Davis, L. M., Shera, E. B. The photophysical constants of several fluorescent dyes pertaining to ultrasensitive fluorescence spectroscopy. Photochem Photobiol. 57, 972-977 (1993).
- Panchuk-Voloshina, N., et al. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).
