التصوير 3-D وتحليل الخلايا العصبية المصابة<em> في فيفو</em> مع<em> التوكسوبلازما</em
Summary
باستخدام هذا البروتوكول، كنا قادرين على الصورة 160 ميكرون أقسام الدماغ سميكة من الفئران المصابة بالطفيلي التوكسوبلازما، والتي تمكن التصور وتحليل العلاقة المكانية بين الطفيلي encysting والخلايا العصبية المصابة.
Abstract
التوكسوبلازما هو إلزام، الطفيليات داخل الخلايا مع مجموعة المضيف واسع، بما في ذلك البشر والقوارض. في كل من البشر والقوارض، التوكسوبلازما يضع العدوى المستمرة مدى الحياة في الدماغ. بينما الإصابة في الدماغ وهذا هو دون أعراض في معظم الناس مناعيا، في وضع الجنين أو الأفراد المناعة مثل متلازمة نقص المناعة (الإيدز) من المرضى، وهذا ميل للوالمثابرة في الدماغ يمكن أن يؤدي إلى مرض عصبي مدمر. وبالتالي، فمن الواضح أن التفاعل التوكسوبلازما brain- أمر حاسم لهذا المرض أعراض التي تنتجها التوكسوبلازما، ولكن لدينا القليل من الفهم والتفاعل الخلوي أو الجزيئية بين خلايا الجهاز العصبي المركزي (CNS) والطفيليات. في نموذج الفأر من الجهاز العصبي المركزي داء المقوسات وقد كان من المعروف لأكثر من 30 عاما أن الخلايا العصبية هي الخلايا التي استمرت الطفيلي، ولكن القليل من المعلومات متاح حول أيجزء من الخلايا العصبية مصاب عموما (سوما، التغصنات، محور عصبي)، وإذا هذه العلاقة الخلوية يتغير بين السلالات. في جزء منه، هذا النقص هو الثانوي لصعوبة التصوير وتصور الخلايا العصبية المصابة كلها من حيوان. ان مثل هذه الصور عادة ما تتطلب باجتزاء المسلسل وخياطة من الأنسجة تصويرها بواسطة المجهر الإلكتروني أو المجهري متحد البؤر بعد المناعية. من خلال الجمع بين عدة تقنيات، الطريقة الموصوفة هنا يمكن استخدام أبواب سميكة (160 ميكرون) لتحديد والصورة كاملة الخلايا التي تحتوي على الخراجات، والسماح التصور والتحليل من الفردية، والخلايا العصبية المصابة بشكل مزمن ثلاثي الأبعاد دون الحاجة لالمناعية، المجهر الإلكتروني ، أو باجتزاء المسلسل وخياطة. باستخدام هذه التقنية، يمكننا أن نبدأ في فهم العلاقة بين الطفيل الخلوية والخلايا العصبية المصابة.
Introduction
ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة هو الحصول على ارتفاع القرار، وصور ثلاثية الأبعاد من الخلايا العصبية الفردية التي تقوم إصابة بطفيل التوكسوبلازما داخل الخلايا إلزام.
غالبا ما تعتبر التوكسوبلازما واحدة من الطفيليات الأكثر نجاحا بسبب مجموعة مضيفه كبير وسيطة، والتي تشمل البشر والقوارض. في كل من البشر والقوارض، بعد العدوى الحادة من خلال تناول طعام أو ماء ملوث، التوكسوبلازما غير قادرة على التسبب في العدوى المستمرة للجهاز العصبي المركزي عن طريق تحويل من شكله تتكاثر بسرعة (على tachyzoite) لالبطيء الطويل تكرار وencysting النموذج (المتباطئة ). في الأفراد مناعيا، ويعتقد أن هذا المرض الجهاز العصبي المركزي الكامنة لتكون أعراض نسبيا، ولكن في الأفراد المناعة مثل مرضى الإيدز أو متلقى، تجدد الطفيلي يمكن أن يؤدي إلى التهاب الدماغ بالمقوسات قاتلة 1،2. وبالإضافة إلى ذلك، الدراسات الحديثة هكتارلقد أظهرت أن العدوى الكامنة مع التوكسوبلازما يمكن أن يؤدي إلى تغيرات سلوكية في القوارض 3،4، على الرغم من أن آلية لا تزال مجهولة.
والمثير للدهشة أنه بالرغم من هذه البيانات تسليط الضوء على أهمية التفاعل CNS- التوكسوبلازما، والقليل نسبيا هو معروف عن هذه العلاقة، وخاصة على المستوى الخلوي والجزيئي. وقد أعاق القدرة على دراسة الجوانب حتى بسيطة للتفاعل الدماغ الطفيلي في جزء من القيود التكنولوجي. على سبيل المثال، فإن الغالبية من العمل تبين أن الخلايا العصبية هي الخلايا التي لا تزال قائمة الخراجات تم القيام به مع المجهر الإلكتروني (EM) 5،6. على الرغم من EM يعطي ارتفاع القرار، وذلك هو مضيعة للوقت، والعمل المكثف، ومكلفة. وقد تم مؤخرا استخدام المناعي (IF) المقايسات بالتزامن مع المجهري متحد البؤر لتأكيد العمل الذي قام به EM 7. IF المقايسات سهلة من الناحية الفنية لأداء وغير مكلفة نسبيا، ولكن باستخدام هذه التقنيات لالفضوليةTAND العلاقة المكانية بين الكيس والخلايا العصبية المصابة تتطلب إعادة الإعمار المسلسل، والتي تستغرق وقتا طويلا، من الصعب من الناحية الفنية، وربما يؤدي إلى فقدان معلومات قيمة. وهكذا، قمنا بتطوير طريقة التي يمكن استخدامها مع نموذج الفأر من الجهاز العصبي المركزي داء المقوسات ويسمح لنا الصورة بكاملها من الخلايا العصبية المصابة دون EM أو المناعية (IHC). من خلال تطوير هذه التقنية، يمكننا أن نبدأ لاستكشاف العلاقة الخلوية بين الخلايا المصابة والكيس بطريقة سريعة وغير مكلفة نسبيا.
طريقة ضعنا يجمع بين التقنيات الحديثة للمقاصة بصريا والتصوير أقسام الدماغ سميكة بواسطة المجهر متحد البؤر 8 مع نظام الذي يصادف في خلايا الجسم الحي التي تم حقنها مع البروتينات الطفيلي 9،10. في هذا النظام، ونحن تصيب الفئران لجنة المساواة العرقية-مراسل التي تعبر عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) إلا بعد لجنة المساواة العرقية بوساطة إعادة التركيب 11 مع التوكسوبلازما </em> السلالات التي تعبر عن البروتين الفلوري الأحمر (RFP) وحقن لجنة المساواة العرقية recombinase في الخلايا المضيفة 9. هذا المزيج يسمح لنا حصاد مخ الفأر المصاب بعد ثبوت العدوى CNS، وقطع أقسام الدماغ سميكة، وبسرعة تحديد المجالات ذات الصلة إلى الصورة من خلال إيجاد RFP + الخراجات. ومن المهم أن نلاحظ أنه مع التعبير الخلية المضيفة من GFP يعتمد فقط على حقن لجنة المساواة العرقية عن الطفيليات، وليس على العدوى، وعدد من الخلايا GFP + لا تحتوي على طفيليات 10. وبما أن الهدف من هذا البروتوكول هو أن تكون قادرة على الصورة كاملة الخلايا العصبية المصابة، ويتم التركيز فقط على GFP + الخلايا العصبية التي تحتوي أيضا على طلب تقديم العروض + الكيس، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم بروتوكول لصورة GFP + / RFP – الخلايا العصبية.
مرة واحدة يتم حصاد الدماغ المصاب ومقطوع، ويتم تقديم الأقسام شفافة عن طريق مسح الجلسرين. ثم يتم تصويرها المناطق المناسبة من المقاطع مع المجهر متحد البؤر، ALخوار التصور غير مسبوق من الخلايا المضيفة المصابة والطفيليات متكيسة في مجملها. هنا نقدم بروتوكول كامل لتحديد وإزالة بصريا، والتصوير إصابة الخلايا العصبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وبالنظر إلى أن التغيرات الخلوية في الخلايا المضيفة المصابة وقد تم ربط لنتائج المرض في العدوى مع الكائنات الحية داخل الخلايا الأخرى مثل فيروس نقص المناعة البشرية، وداء الكلب، والكلاميديا 18،19، قمنا بتطوير تقنية من شأنها أن تسمح لنا لدراسة التفاعلات الحميمة …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر مختبر كوشي كامل لإجراء مناقشات مفيدة. نشكر باتي Jansma وجامعة ولاية اريزونا وزارة العلوم العصبية للحصول على المشورة والمساعدة في التصوير. كما نشكر مختبر Porreca لاستخدام Vibratome بهم. وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية الأميركية للصحة (NIH NS065116، AAK).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Vibratome Series 1000 Sectioning System | Technical Products International, Inc. | Other vibratomes are compatible | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Premium Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| #1.5 Coverslips | VWR | 48393 251 | |
| Diamond Scriber | VWR | 52865-005 | |
| Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100mg/ml | Western Medical Supply, Inc. | 4165 | |
| AnaSed® Injection Xylazine 20mg/ml | Lloyd Inc. | ||
| ZsGreen Mice | Jackson Laboratories | 7906 | B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J |
| Surgical equipment | Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula. | ||
| Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells | These are primary cells from human foreskins. We make these in-house but they may be purchased from outside vendors. | ||
| Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM) | HyClone | SH30081.01 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
| 200mM L-alanyl-L-glutamine | Corning | 25-015-Cl | |
| 25cm2 Canted neck flask | Fisher Scientific | 1012639 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | VWR | 45000-446 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 10X, USP Sterile Ultra Pure Grade | amresco | K813-500ml | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Bright-Line Hemocytometer | Sigma-aldrich | Z359629-1EA | |
| Mouse Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSMAS005-1 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-aldrich | H3393-100KU | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 20ml Disposable Scintillation Vials | Fisher Scientific | FS74500-20 | |
| Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof | In-house | 17212945 | This product is purchased from an in-house stockroom. Other companies are compatible. |
| Imaris Software | Bitplane | ||
| Clear nail polish | Other brands are compatible | ||
| 10ml Syringe with Luer-Lok | VWR | BD309604 | Other syringes are compatible |
| Three-way Stopcock | Any brand is compatible | ||
| Hypodermic needle | Any brand is compatible – used to pin down mouse. | ||
| Cell Scraper | Any brand is compatible | ||
| 25G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter | Greiner Bio-One | 450099 | Other brands are compatible |
References
- Luft, B., Remington, J. Toxoplasmic encephalitis in AIDS. Clin Infect Dis. 15 (2), 211-222 (1992).
- Hill, D., Dubey, J. P. Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention. Clin Microbiol Infect. 8 (10), 634-640 (2002).
- Ingram, W. M., Goodrich, L. M., Robey, E., Eisen, M. B. Mice infected with low-virulence strains of Toxoplasma gondii lose their innate aversion to cat urine, even after extensive parasite clearance. PloS one. 8 (9), 75246 (2013).
- Evans, A. K., Strassmann, P. S., Lee, I. -. P., Sapolsky, R. M. Patterns of Toxoplasma gondii cyst distribution in the forebrain associate with individual variation in predator odor avoidance and anxiety-related behavior in male Long-Evans rats. Brain Behav Immun. 37, 122-133 (2013).
- Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. The host-parasite relationship of Toxoplasma gondii in the brains of chronically infected mice. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 411 (1), 39-43 (1987).
- Ferguson, D. J., Graham, D. I., Hutchison, W. M. Pathological changes in the brains of mice infected with Toxoplasma gondii: a histological, immunocytochemical and ultrastructural study. Int J Exp Pathol. 72 (4), 463-474 (1991).
- Melzer, T. C., Cranston, H. J., Weiss, L. M., Halonen, S. K. Host Cell Preference of Toxoplasma gondii Cysts in Murine Brain: A Confocal Study. J Neuroparasitology. , (2010).
- Selever, J., Kong, J. -. Q., Arenkiel, B. R. A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices. J Vis Exp. (53), (2011).
- Koshy, A., Fouts, A., Lodoen, M., Alkan, O. Toxoplasma secreting Cre recombinase for analysis of host-parasite interactions. Nat Methods. 7 (4), 307-309 (2010).
- Koshy, A. a., Dietrich, H. K., et al. Toxoplasma co-opts host cells it does not invade. PLoS pathog. 8 (7), (2012).
- Madisen, L., Zwingman, T. a., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
- Caffaro, C. E., Koshy, A. s., Liu, L., Zeiner, G. M., Hirschberg, C. B., Boothroyd, J. C. A nucleotide sugar transporter involved in glycosylation of the Toxoplasma tissue cyst wall is required for efficient persistence of bradyzoites. PLoS pathog. 9 (5), (2013).
- Saeij, J. P. J., Boyle, J. P., Boothroyd, J. C. Differences among the three major strains of Toxoplasma gondii and their specific interactions with the infected host. Trends in parasitology. 21 (10), 476-481 (2005).
- Dubey, J. P., Lindsay, D. S., Speer, C. a Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts. Clin Microbiol Rev. 11 (2), 267-299 .
- Prandota, J. Possible Link Between Toxoplasma Gondii and the Anosmia Associated With Neurodegenerative Diseases. Am J Alzheimers Dis Other Demen. 29 (3), 205-214 (2014).
- Berenreiterová, M., Flegr, J., Kuběna, A., Němec, P. The distribution of Toxoplasma gondii cysts in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioral manipulation hypothesis. PloS one. 6 (12), 28925 (2011).
- Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. An ultrastructural study of the early development and tissue cyst formation of Toxoplasma gondii in the brains of mice. Parasitol Res. 73 (6), 483-491 (1987).
- De Chiara, G., Marcocci, M. E., et al. Infectious agents and neurodegeneration. Mol Neurobiol. 46 (3), 614-638 (2012).
- Scott, C. a., Rossiter, J. P., Andrew, R. D., Jackson, A. C. Structural abnormalities in neurons are sufficient to explain the clinical disease and fatal outcome of experimental rabies in yellow fluorescent protein-expressing transgenic mice. J Virol. 82 (1), 513-521 (2008).
- Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
