3-D Imaging og analyse av nevroner Infected<em> I Vivo</em> Med<em> Toxoplasma gondii</em

Summary

Ved hjelp av denne protokollen, var vi i stand til bilde 160 mikrometer tykk hjerne seksjoner fra mus infisert med parasitten Toxoplasma gondii, som gjør det mulig for visualisering og analyse av romlige forholdet mellom encysting parasitt og den infiserte nervecellen.

Abstract

Toxoplasma gondii er en obligat, intracellulær parasitt med et bredt vertsområde, inkludert mennesker og gnagere. I både mennesker og gnagere, etablerer Toxoplasma en livslang vedvarende infeksjon i hjernen. Mens denne hjerneinfeksjon er asymptomatisk i de fleste immunkompetente mennesker, i fosteret eller immunsupprimerte individer som ervervet immunsvikt syndrom (AIDS) pasienter, dette forkjærlighet for og utholdenhet i hjernen kan føre til ødeleggende nevrologisk sykdom. Således er det klart at hjerne Toxoplasma interaksjonen er kritisk for symptomatisk sykdom produsert av Toxoplasma, men vi har liten forståelse av cellulær eller molekylær interaksjon mellom cellene i sentralnervesystemet (CNS) og parasitten. I musemodell for CNS toksoplasmose det har vært kjent i over 30 år at nevroner er de cellene der parasitten vedvarer, men lite informasjon er tilgjengelig om hvilkedel av nervecellen er generelt infisert (soma, Dendritt, axon) og hvis dette cellulære forhold endrer mellom stammer. Delvis er denne mangelen sekundært til vanskelighetene med bildebehandling og visualisere hele infiserte nevroner fra et dyr. Slike bilder vil vanligvis krever serie seksjonering og søm av vev avbildes ved elektronmikroskopi eller konfokalmikroskopi etter farging. Ved å kombinere flere teknikker, fremgangsmåten som beskrives her muliggjør bruk av tykke seksjoner (160 um) for å identifisere og bilde hele celler som inneholder cyster, slik tredimensjonal visualisering og analyse av individuelle, kronisk infiserte neuroner uten behov for farging, elektronmikroskopi eller seriell seksjonering og søm. Ved hjelp av denne teknikken, kan vi begynne å forstå den cellulære forholdet mellom parasitt og den infiserte nervecellen.

Introduction

Det overordnede målet med denne metoden er å oppnå høy oppløsning, tredimensjonale bilder av individuelle nerveceller som er infisert av den obligat intracellulær parasitt Toxoplasma gondii.

Toxoplasma er ofte betraktet som en av de mest vellykkede parasitter på grunn av sin store mellomvert utvalg, som omfatter mennesker og gnagere. I både mennesker og gnagere, etter akutt infeksjon gjennom inntak av forurenset mat eller vann, er Toxoplasma stand til å forårsake en vedvarende infeksjon i CNS ved å konvertere fra sin raske reproduserende form (den tachyzoite) til sin langsomme reproduserende og encysting form (den bradyzoite ). I immunkompetente individer, er dette latent CNS infeksjon antas å være relativt asymptomatisk, men hos immunsupprimerte individer som AIDS-pasienter eller resipienter, kan recrudescence av parasitten føre til dødelig toxoplasmic encefalitt ^1,2. I tillegg nyere studier hahar vist at latent infeksjon med Toxoplasma kan føre til forandringer i oppførselen hos gnagere ^3,4, men mekanismen er ikke kjent.

Overraskende, til tross for disse data fremhever viktigheten av CNS Toxoplasma samhandling, relativt lite er kjent om dette forholdet, spesielt på cellulært og molekylært nivå. Evnen til å studere selv enkle aspekter av hjerne-parasitt interaksjon har vært hemmet delvis av techno begrensninger. For eksempel, det meste av arbeidet som viser at nerveceller er celler som cyster vedvarer har blitt gjort med elektronmikroskopi (EM) ^5,6. Selv om EM gir høy oppløsning, er det tidkrevende, arbeidskrevende og dyrt. Immunfluorescens (If) assays har nylig blitt anvendt i forbindelse med konfokal mikroskopi for å bekrefte arbeid utført av EM ^7. Hvis analyser er teknisk enkel å utføre og relativt billig, men ved anvendelse av disse teknikker for å understand det romlige forhold mellom cyste og infisert neuron krever serie rekonstruksjon, noe som er tidkrevende, teknisk vanskelig, og kan føre til tap av verdifull informasjon. Derfor har vi utviklet en metode som kan brukes med musemodell for CNS toksoplasmose og lar oss bilde helheten av infiserte nevroner uten EM eller immunhistokjemi (IHC). Ved utvikling av en slik teknikk, kan vi begynne å utforske den cellulære forholdet mellom den infiserte celle og cyste i en forholdsvis rask og rimelig måte.

Metoden utviklet vi kombinerer nyere teknikker for optisk avregning og avbildnings tykke hjerneseksjoner ved konfokal mikroskopi ⁸ med et system som markerer in vivo-celler som har blitt injisert med parasittproteiner ^9,10. I dette systemet, vi infisere Cre-rapportør mus som uttrykker et grønt fluorescerende protein (GFP) først etter at Cre-formidlet rekombinasjon ¹¹ med Toxoplasma </em> Stammer som uttrykker en rød fluorescerende protein (RFP) og injisere Cre rekombinase i vertsceller ^9. Denne kombinasjonen gjør at vi kan høste den infiserte mus hjernen etter CNS infeksjon er etablert, kutte tykke hjerne seksjoner, og raskt identifisere relevante områder til bilde ved å finne den RFP ⁺ cyster. Det er viktig å merke seg at som vertscelle ekspresjon av GFP avhenger utelukkende på injeksjon av Cre av parasitter, og ikke på infeksjon, en rekke av de GFP ⁺ celler inneholder ikke parasitter ^10. Som mål for denne protokollen er å være i stand til bilde hele infiserte nevroner, er fokuset kun på GFP ⁺ nevroner som også inneholder en RFP ⁺ cyste, men protokollen kan også brukes til å avbilde GFP ⁺ / RFP ^– nevroner.

Når den infiserte hjernen blir høstet og seksjonert, blir seksjonene gjøres gjennomsiktig ved glycerol clearing. Passende regioner av seksjoner blir deretter avbildes med konfokalmikroskopi, algende enestående visualisering av infiserte vertsceller og de innkapslede parasitter i sin helhet. Her tilbyr vi en komplett protokoll for å identifisere, optisk clearing, og bildebehandling smittet nevroner.

Protocol

MERK: Mus ble avlet og vedlikeholdes på en temperatur og luftfuktighet kontrollert rom med 12 timers reversert lys / mørke sykluser med mat og vann tilgjengelig ad libitum ved University of Arizona. Forsøkene ble utført under retningslinjer og godkjenning av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Arizona. Alle forsøk ble gjort for å minimere lidelse. De Cre-rapportør musene er på en C57BL / 6 bakgrunn 11 og er kommersielt tilgjengelige. 1. Mouse…

Representative Results

Figur 7 inneholder representative bilder av to cyste-inneholdende GFP + neuroner fra to forskjellige 160 um tykke seksjoner samt en representativ måling av avstanden fra cyste-til-celle-legemet for figur 7B. Figurer 7 A og B viser at denne nye Protokollen muliggjør visualisering av den infiserte neuron i sin helhet. Figur 7C viser at med denne avbildningsteknikk, er det nå mulig å kvantifisere avstanden mellom cyste og cellelegemet (Imari…

Discussion

Gitt at celleforandringer i infiserte vertsceller har vært knyttet til sykdoms utfall i infeksjoner med andre intracellulære organismer som HIV, Rabies, og Chlamydia ^18,19, har vi utviklet en teknikk som ville tillate oss å studere de intime samspillet som oppstår mellom CNS vert celle og Toxoplasma. Metoden som beskrives her oppnår dette målet ved at effektiv avbildning av kronisk infiserte neuroner. Forut for utviklingen av denne fremgangsmåte, slik avbilding var tidkrevende, kostbare, eller…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Vibratome Series 1000 Sectioning System	Technical Products International, Inc.		Other vibratomes are compatible
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Premium Slides	Fisher Scientific	12-544-2
#1.5 Coverslips	VWR	48393 251
Diamond Scriber	VWR	52865-005
Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100mg/ml	Western Medical Supply, Inc.	4165
AnaSed® Injection Xylazine 20mg/ml	Lloyd Inc.
ZsGreen Mice	Jackson Laboratories	7906	B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J
Surgical equipment			Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells			These are primary cells from human foreskins.  We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.
Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)	HyClone	SH30081.01
Penicillin Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-Cl
200mM L-alanyl-L-glutamine	Corning	25-015-Cl
25cm2 Canted neck flask	Fisher Scientific	1012639
Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium	VWR	45000-446
Phosphate-Buffered Saline, 10X, USP Sterile Ultra Pure Grade	amresco	K813-500ml
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079
Bright-Line Hemocytometer	Sigma-aldrich	Z359629-1EA
Mouse Brain Slicer Matrix	Zivic Instruments	BSMAS005-1
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-aldrich	H3393-100KU
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042-500
20ml Disposable Scintillation Vials	Fisher Scientific	FS74500-20
Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof	In-house	17212945	This product is purchased from an in-house stockroom.  Other companies are compatible.
Imaris Software	Bitplane
Clear nail polish			Other brands are compatible
10ml Syringe with Luer-Lok	VWR	BD309604	Other syringes are compatible
Three-way Stopcock			Any brand is compatible
Hypodermic needle			Any brand is compatible – used to pin down mouse.
Cell Scraper			Any brand is compatible
25G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter	Greiner Bio-One	450099	Other brands are compatible