3-D изображений и анализ нейронов Infected<em> В Vivo</em> С<em> Токсоплазма</em
Summary
Используя этот протокол, мы смогли изображение 160 мкм срезы толщиной головного мозга мышей, инфицированных паразитом Toxoplasma Gondii, что позволяет визуализации и анализа пространственных отношений между encysting паразита и зараженной нейрона.
Abstract
Токсоплазма является облигатным, внутриклеточным паразитом с широким спектром хозяев, включая человека и грызунов. В обоих людей и грызунов, Toxoplasma устанавливает пожизненную хроническую инфекцию в мозге. В то время как эта инфекция мозга протекает бессимптомно, в большинстве людей с нормальным иммунитетом, в развивающегося плода или ослабленных лиц, таких как синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) больных, в этом пристрастии к и настойчивости в мозге может привести к разрушительным неврологических заболеваний. Таким образом, очевидно, что взаимодействие мозговой Toxoplasma является критическим для симптоматической болезнью производимого Toxoplasma, пока мы имеем слабое представление о клеточном или молекулярном взаимодействии клеток центральной нервной системы (ЦНС) и паразита. В мышиной модели ЦНС Токсоплазмоз было известно на протяжении 30 лет, что нейроны являются клетки, в которых паразит сохраняется, но мало информации о том, какиечасть нейрона обычно заражены (сома, дендритов, аксонов), и если это сотовой отношения меняет между штаммами. В частности, это отсутствие является вторичным по отношению к сложности визуализации и визуализации целые зараженные нейроны от животного. Такие изображения, как правило, требуют последовательного секционирования и сшивание тканей отображаемого с помощью электронной микроскопии или конфокальной микроскопии после иммунной окраски. Объединив несколько методов, способ, описанный здесь, обеспечивает возможность использования толстых секций (160 мкм), чтобы идентифицировать и изображения целых клеток, которые содержат цисты, что позволяет трехмерной визуализации и анализа отдельных, хронически инфицированных нейронов без необходимости иммунным, электронная микроскопия или серийный секционирования и шить. Используя эту технику, мы можем начать понимать сотовой отношения между паразитом и зараженной нейрона.
Introduction
Основная цель данного метода является получение высокого разрешения, трехмерные изображения отдельных нейронов, которые заражены облигатной внутриклеточным паразитом Toxoplasma Gondii.
Toxoplasma часто считается одним из самых успешных паразитов из-за его большой промежуточной области хоста, которое включает в себя людей и грызунов. В обоих людей и грызунов, после острой инфекции при проглатывании зараженной пищи или воды, Toxoplasma может привести к хронической инфекции ЦНС путем преобразования из его форму быстрого дуплицируемый (в tachyzoite) в его медленном тиражирования и encysting форму (bradyzoite ). В иммунокомпетентных лиц, это латентное инфекции ЦНС, как полагают, чтобы быть относительно бессимптомно, но в индивидуумов с ослабленным иммунитетом, таких как больных СПИДом или реципиентов, рецидив паразита может привести к фатальной toxoplasmic энцефалита 1,2. Кроме того, недавние исследования гаве показали, что скрытая инфекция с токсоплазмозом может привести к поведенческим изменениям у грызунов 3,4, хотя механизм остается неизвестным.
Удивительно, но, несмотря на эти данные, подчеркнув важность взаимодействия CNS- Toxoplasma, относительно мало известно об этом отношений, особенно на клеточном и молекулярном уровне. Способность к обучению даже простые аспекты мозговой паразит взаимодействия была затруднена в части технологических ограничений. Например, большинство работы, показывающие, что нейроны клетки, в которой сохраняются кисты было сделано с электронной микроскопии (ЭМ) 5,6. Хотя EM дает высокое разрешение, это занимает много времени, трудоемкий, и дорого. Иммунофлуоресценции (ИФ) анализы недавно были использованы в сочетании с конфокальной микроскопии, чтобы подтвердить проделанную EM 7. Если анализы технически легко выполнить и относительно недороги, но при использовании этих методов, чтобы UndersТ и пространственное соотношение между кистой и инфицированных нейрона требуется серийный реконструкцию, которая занимает много времени, технически сложно, и может привести к потере ценной информации. Таким образом, мы разработали метод, который может быть использован с мышиной модели ЦНС токсоплазмоза и позволяет изображению полноту инфицированных нейронов без их или иммуногистохимии (IHC). Развивая такую технику, мы можем начать изучение клеточного отношения между инфицированной клетки и кисты относительно быстро и недорогим способом.
Метод, который мы разработали сочетает в себе новые технологии для оптически очистки и толстых срезов головного мозга визуализации с помощью конфокальной микроскопии 8 с системой, которая отмечает в естественных условиях клетки, которые были введены с паразитов белков 9,10. В этой системе, мы заражают Cre-репортер мышей, которые экспрессируют зеленый флуоресцентный белок (GFP) только после того, как Cre-опосредованного рекомбинации 11 с Toxoplasma </em> Штаммы, которые выражают красный флуоресцентный белок (RFP) и инъекционные Cre рекомбиназу в клетках-хозяевах 9. Это сочетание позволяет нам использовать зараженный мозг мыши после инфекции ЦНС установлено, вырезать толстые срезы головного мозга, и быстро идентифицировать соответствующие области, чтобы изображение путем нахождения RFP + кисты. Важно отметить, что, как клетка-хозяин выражение GFP зависит только от инъекции Cre паразитами, а не на инфекции, количество GFP + клеток не содержат паразитов 10. Поскольку целью данного протокола является, чтобы иметь возможность изображения целых инфицированных нейронов, в центре внимания находится только на GFP + нейронов, которые также содержат ППП + кисту, но протокол также может быть использован для изображения GFP + / RFP – нейроны.
После того, как зараженный мозг собирают и срезы, срезы оказываются прозрачным глицерина очистки. Соответствующие регионы разделах затем полученную с конфокальной микроскопии, альмычание беспрецедентный визуализация инфицированных клетках-хозяевах и осумкованный паразитов во всей их полноте. Здесь мы предлагаем полный протокол для выявления оптически клиринга и обработки изображений заражены нейронов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Учитывая, что клеточные изменения в инфицированных клетках-хозяевах были связаны с результатами болезни при инфекциях с другими внутриклеточными организмами, такими как ВИЧ, бешенство, и Chlamydia 18,19, мы разработали методику, которая позволила бы нам изучать интимные взаимодействи?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим весь лабораторию Koshy за полезные обсуждения. Мы благодарим Patty Jansma и Университета Аризоны Neuroscience Департамента за советом и помощью с изображениями. Мы также благодарим лабораторию Porreca для использования их Vibratome. Это исследование было поддержано американским Национальным институтом здоровья (NIH NS065116, АБК).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Vibratome Series 1000 Sectioning System | Technical Products International, Inc. | Other vibratomes are compatible | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Premium Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| #1.5 Coverslips | VWR | 48393 251 | |
| Diamond Scriber | VWR | 52865-005 | |
| Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100mg/ml | Western Medical Supply, Inc. | 4165 | |
| AnaSed® Injection Xylazine 20mg/ml | Lloyd Inc. | ||
| ZsGreen Mice | Jackson Laboratories | 7906 | B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J |
| Surgical equipment | Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula. | ||
| Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells | These are primary cells from human foreskins. We make these in-house but they may be purchased from outside vendors. | ||
| Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM) | HyClone | SH30081.01 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
| 200mM L-alanyl-L-glutamine | Corning | 25-015-Cl | |
| 25cm2 Canted neck flask | Fisher Scientific | 1012639 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | VWR | 45000-446 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 10X, USP Sterile Ultra Pure Grade | amresco | K813-500ml | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Bright-Line Hemocytometer | Sigma-aldrich | Z359629-1EA | |
| Mouse Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSMAS005-1 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-aldrich | H3393-100KU | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 20ml Disposable Scintillation Vials | Fisher Scientific | FS74500-20 | |
| Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof | In-house | 17212945 | This product is purchased from an in-house stockroom. Other companies are compatible. |
| Imaris Software | Bitplane | ||
| Clear nail polish | Other brands are compatible | ||
| 10ml Syringe with Luer-Lok | VWR | BD309604 | Other syringes are compatible |
| Three-way Stopcock | Any brand is compatible | ||
| Hypodermic needle | Any brand is compatible – used to pin down mouse. | ||
| Cell Scraper | Any brand is compatible | ||
| 25G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter | Greiner Bio-One | 450099 | Other brands are compatible |
References
- Luft, B., Remington, J. Toxoplasmic encephalitis in AIDS. Clin Infect Dis. 15 (2), 211-222 (1992).
- Hill, D., Dubey, J. P. Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention. Clin Microbiol Infect. 8 (10), 634-640 (2002).
- Ingram, W. M., Goodrich, L. M., Robey, E., Eisen, M. B. Mice infected with low-virulence strains of Toxoplasma gondii lose their innate aversion to cat urine, even after extensive parasite clearance. PloS one. 8 (9), 75246 (2013).
- Evans, A. K., Strassmann, P. S., Lee, I. -. P., Sapolsky, R. M. Patterns of Toxoplasma gondii cyst distribution in the forebrain associate with individual variation in predator odor avoidance and anxiety-related behavior in male Long-Evans rats. Brain Behav Immun. 37, 122-133 (2013).
- Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. The host-parasite relationship of Toxoplasma gondii in the brains of chronically infected mice. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 411 (1), 39-43 (1987).
- Ferguson, D. J., Graham, D. I., Hutchison, W. M. Pathological changes in the brains of mice infected with Toxoplasma gondii: a histological, immunocytochemical and ultrastructural study. Int J Exp Pathol. 72 (4), 463-474 (1991).
- Melzer, T. C., Cranston, H. J., Weiss, L. M., Halonen, S. K. Host Cell Preference of Toxoplasma gondii Cysts in Murine Brain: A Confocal Study. J Neuroparasitology. , (2010).
- Selever, J., Kong, J. -. Q., Arenkiel, B. R. A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices. J Vis Exp. (53), (2011).
- Koshy, A., Fouts, A., Lodoen, M., Alkan, O. Toxoplasma secreting Cre recombinase for analysis of host-parasite interactions. Nat Methods. 7 (4), 307-309 (2010).
- Koshy, A. a., Dietrich, H. K., et al. Toxoplasma co-opts host cells it does not invade. PLoS pathog. 8 (7), (2012).
- Madisen, L., Zwingman, T. a., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
- Caffaro, C. E., Koshy, A. s., Liu, L., Zeiner, G. M., Hirschberg, C. B., Boothroyd, J. C. A nucleotide sugar transporter involved in glycosylation of the Toxoplasma tissue cyst wall is required for efficient persistence of bradyzoites. PLoS pathog. 9 (5), (2013).
- Saeij, J. P. J., Boyle, J. P., Boothroyd, J. C. Differences among the three major strains of Toxoplasma gondii and their specific interactions with the infected host. Trends in parasitology. 21 (10), 476-481 (2005).
- Dubey, J. P., Lindsay, D. S., Speer, C. a Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts. Clin Microbiol Rev. 11 (2), 267-299 .
- Prandota, J. Possible Link Between Toxoplasma Gondii and the Anosmia Associated With Neurodegenerative Diseases. Am J Alzheimers Dis Other Demen. 29 (3), 205-214 (2014).
- Berenreiterová, M., Flegr, J., Kuběna, A., Němec, P. The distribution of Toxoplasma gondii cysts in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioral manipulation hypothesis. PloS one. 6 (12), 28925 (2011).
- Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. An ultrastructural study of the early development and tissue cyst formation of Toxoplasma gondii in the brains of mice. Parasitol Res. 73 (6), 483-491 (1987).
- De Chiara, G., Marcocci, M. E., et al. Infectious agents and neurodegeneration. Mol Neurobiol. 46 (3), 614-638 (2012).
- Scott, C. a., Rossiter, J. P., Andrew, R. D., Jackson, A. C. Structural abnormalities in neurons are sufficient to explain the clinical disease and fatal outcome of experimental rabies in yellow fluorescent protein-expressing transgenic mice. J Virol. 82 (1), 513-521 (2008).
- Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
