المبيضات البيض بيوفيلم التنمية على الهيئات الأجنبية طبيا ذات الصلة في الماوس تحت الجلد نموذج تلاه ضوء بارد التصوير
Summary
We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.
Abstract
المبيضات البيض تطوير بيوفيلم على الأسطح الحيوية و / أو غير الحيوية تمثل تهديدا محددا لمرضى المستشفى. وحتى الآن، C. وقد تم دراسة الأغشية الحيوية البيض في الغالب في المختبر ولكن هناك حاجة ماسة لفهم أفضل لهذه العملية الديناميكية في ظل ظروف في الجسم الحي. قمنا بتطوير نموذج الفئران تحت الجلد في الجسم الحي لدراسة C. تشكيل بيوفيلم البيض. في نموذجنا، متعددة (ما يصل إلى 9) وزرع أجهزة -infected المبيضات إلى الجزء الخلفي من الحيوان. هذا يعطينا ميزة كبيرة على نظام نموذجي القسطرة الوريدية المركزية لأنها تسمح لنا لدراسة عدة الأغشية الحيوية المستقلة في حيوان واحد. مؤخرا، ونحن تكييفها هذا النموذج لدراسة C. تطوير بيوفيلم البيض في BALB / ج الفئران. في هذا النموذج، تنضج C. الأغشية الحيوية البيض تتطور خلال 48 ساعة وتظهر العمارة بيوفيلم ثلاثية الأبعاد النموذجية. القياس الكمي لبيوفيلم الفطريةويتم تحليل تقليديا بعد الوفاة ويتطلب التضحية المضيف. لأن هذا يتطلب استخدام العديد من الحيوانات لإجراء دراسات الحركية، طبقنا غير الغازية تلألؤ بيولوجي التصوير (BLI) لمتابعة طولي يصل في الجسم الحي تنضج C. البيض الأغشية الحيوية النامية في نموذج تحت الجلد لدينا. C. تم هندستها خلايا البيض للتعبير عن Gaussia princeps luciferase المراسل الجين (gLuc) تعلق على جدار الخلية. ويتم إنتاج إشارة تلألؤ بيولوجي من قبل luciferase المراسل أن يحول coelenterazine الركيزة أضاف في الضوء الذي يمكن قياسها. إشارة BLI تشبه عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من القسطرة explanted. التصوير غير الغازية لقياس في تشكيل الجسم الحي بيوفيلم يوفر تطبيقات فورية لفحص والتحقق من الأدوية المضادة للفطريات في ظل ظروف في الجسم الحي، فضلا عن الدراسات التي تعتمد على التفاعلات المضيف الممرض، تساهم بموجبه إلى فهم أفضل لجي من التسبب في العدوى المرتبطة القسطرة.
Introduction
المبيضات البيض هو كائن المتعايشة، التي يمكن العثور عليها في مواقع مختلفة من الأفراد الأصحاء، على سبيل المثال على الجلد أو جزء من الجهاز الهضمي والنباتات المهبلية. ومع ذلك، في المستشفى، وخصوصا مرضى نقص المناعة، فإنه قد يسبب مجموعة واسعة من الالتهابات 1. في هؤلاء الأفراد، وضعف الجهاز المناعي يسمح خلايا المبيضات لنشر إلى مجرى الدم وتغزو الأنسجة العميقة يسبب العدوى المهددة للحياة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن وجود ركائز غير الحيوية مثل القسطرة الوريدية المركزية والمسالك البولية، وصمامات القلب الاصطناعية والمفاصل قد توفر مكانا لالمبيضات مرفق 2. الانضمام إلى مثل هذه ركائز هو شرط أساسي لمزيد من التطوير بيوفيلم، وهو ما يمثل طبقة من الخميرة وخوطي خلايا جزءا لا يتجزأ من المواد البوليمرية خارج الخلية، التي تتألف أساسا من السكريات 2. C. البيض قسطرة -associated العدوىوترتبط مع ارتفاع معدل الوفيات. والسمة العامة للالأغشية الحيوية هي قابلية انخفضت لمضادات الفطريات المعروفة، مثل الأزولات 3،4. أثبتت أحدث فصول فقط من الأدوية المضادة للفطريات، مثل echinocandins وصياغة liposomal من الأمفوتريسين B لتكون فعالة ضد العدوى المرتبطة القسطرة 5-7. بسبب بيوفيلم القدرة على مقاومة مضادات الفطريات، والنهج العلاجية محدودة جدا، وغالبا ما يؤدي إلى إزالة القسطرة واستبدال لاحقا كحل وحيد.
أكثر من الفهم الحالي للC. لدينا تنبع تطوير بيوفيلم البيض من الدراسات في المختبر على ركائز غير الحيوية مثل البوليسترين، أو المواد البلاستيكية المستخدمة لتصنيع الأجهزة المذكورة أعلاه، أي سيليكون، البولي يوريثين 2. هذه النماذج هي متقدمة جدا ومحاولة لتقليد الوضع في الجسم الحي بأكبر قدر ممكن. ومع ذلك، فإن هذه الأنظمة لا تنطوي على تدفق الدم المستمر وركان الجهاز المناعي للمضيف. وأدى ذلك إلى تطوير نظم نموذج في الجسم الحي، مثل القسطرة الوريدية المركزية (سي) نموذج 8-10، ونموذج التهاب الفم أسنان من داء المبيضات الفموي 11 ونموذج الفئران لالمصاحب قسطرة بيلة المبيضات 12. بالإضافة إلى ذلك، C. تمت دراسة تطوير بيوفيلم البيض في الجسم الحي على الأسطح المخاطية، مثل تلك التي من المهبل عن طريق الفم تجويف 13 و 14. ساهم مختبرنا مع إنشاء C. تحت الجلد البيض نموذج بيوفيلم، والتي تقوم على زرع من القطع القسطرة المصابة على الجزء الخلفي من الفئران سبراغ داولي 15. وقد استخدم هذا النموذج بنجاح في المختبر لدينا لاختبار قابلية بيوفيلم لفلوكونازول وechinocandin المخدرات 5،16، لدراسة تأثير العلاج اندماجي من ديكلوفيناك وcaspofungin 17. وفي الآونة الأخيرة، فإننا تكييفها هذا النظام لاستخدامها في BALB / ج الفئران 18،19. فيمقارنة مع غيرها في نماذج الجسم الحي، والميزة الرئيسية لهذا النموذج تحت الجلد هو إمكانية لدراسة الأغشية الحيوية متعددة لكل حيوان وضعت داخل التجويف من القطع قسطرة مزروع.
للحد من عدد الحيوانات المختبرية، وتكيفنا هذا النموذج لدراسة تطوير C. البيض الأغشية الحيوية غير جراحية باستخدام التصوير تلألؤ بيولوجي (BLI) 18،19. أثبتت هذه الطريقة أن تكون تقنية قوية، والتي يمكن استخدامها لقياس الأغشية الحيوية عن طريق قياس إشارة محددة BLI في المنطقة ذات الاهتمام (في حالتنا مجال القسطرة زرعها)، وتجنب التضحية الحيوانية. وبالمقارنة مع البكتيريا، والتي يمكن التعبير عن كل من الجينات والركيزة اللازمة للتفاعل تلألؤ بيولوجي نظرا لإدخال لوكس الاوبرون محدد 20، ومعظم الكائنات الحية حقيقية النواة، بما في ذلك C. البيض، تعتمد على التعبير مغاير من الجين luciferase المراسل إلى جانبالإدارة الخارجية للركيزة محددة، مثل D-وسيفيرين أو coelenterazine 21. وربما يرجع ذلك إلى وجود جدار الخلية الفطرية وC. كان البيض التشكل، والتسليم داخل الخلايا الركيزة للانزيم luciferase المراسل تحديا الرئيسي 21. من أجل حل هذه المشكلة، Enjalbert وآخرون 22 هندسيا سلالة حيث C. الاصطناعية وقد تنصهر البيض الإصدار الأمثل كودون من الجينات ليفرز بشكل طبيعي Gaussia princeps luciferase المراسل (gLuc) للC. البيض PGA59 الجينات، ترتكز على GPI- بروتين جدار الخلية. بسبب وجود luciferase المراسل في جدار الخلية، ويمكن تجنب المشاكل المتعلقة توافر داخل الخلايا الركيزة. وقد استخدم هذا النظام بشكل خاص لدراسة التهابات سطحية الناجمة عن C. البيض 22. قريب جدا، كان يستخدم BLI أيضا لمتابعة تطور داء المبيضات الفموي البلعومي وامكن لهاالعلاج ه 23. هذه النتائج تدعم استخدام BLI باعتبارها تقنية واعدة لدراسة الالتهابات التي تسببها الخلايا التي تعيش بحرية ولكن أيضا العدوى المرتبطة الجهاز.
في هذه الدراسة، فإننا وصف C. تطوير بيوفيلم البيض على قطع القسطرة البولي يوريثان في الفئران BALB / ج وتقدير لها باستخدام BLI. ونحن نقدم بروتوكول مفصلة في المختبر استعمار القسطرة البولي يوريثين خلال الفترة من التصاق تليها زرع في الفئران والتنمية بيوفيلم اللاحقة في الحيوانات الحية. وبصرف النظر عن قياس إشارة BLI المنبعثة من C. خلايا البيض، ونحن أيضا تحديد مستعمرة للمقارنة مع تقنية قياسية لبيوفيلم الفطرية الحمل الكمي.
Protocol
Representative Results
Discussion
استخدام النماذج الحيوانية، ونماذج القوارض وخاصة، للدراسات مخصصة لالأغشية الحيوية الميكروبية مهم جدا لجهاز المناعة المضيف هو عامل أساسي في تشكيل بيوفيلم أن النماذج في المختبر لا يمكن حساب ل. في هذه الدراسة، نحن تصف تحت الجلد C. واضحة نسبيا البيض نموذج ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the KU Leuven PF ‘IMIR’, the FWO Research community on biology and ecology of bacterial and fungal biofilms (FWO: WO.026.11N) and by the FWO project G.0804.11. SK gratefully acknowledges KU Leuven for the PDMK 11/089 fellowship and FWO for the postdoctoral fellowship. We are grateful to Nico Vangoethem for his assistance with preparation of the figures. We would like to acknowledge Celia Lobo Romero for technical assistance during in vivo experimental procedures.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Yeast extract granulated | Merck | MERC1.03753.0500 | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP037B | |
| Agar granulated | Difco | 214530 | |
| D-(+)-glucose | Fluka | 49159-5KG | |
| Phosphate buffered saline | Prepared in the laboratory | for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 | |
| RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate | Sigma | R6504-1L | Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing |
| 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma | M1254 | MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0) |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730) | BBraun | CV-15703 | Polyurethane part cut into 1 cm pieces |
| Dexamethasone | Fagron SAS, France | 611139 | Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml) |
| Ampicillin | Duchefa Biochemie, The Netherlands | A0104 | Antibacterial prophylaxis |
| Ketamine 1000 | Pfizer | 804 119 | Anesthetic |
| Domitor | Pfizer | 134737-1 | Anesthetic |
| Antisedan | Pfizer | 134783-2 | Reversal of anesthesia |
| Xylocaine gel (2%) – this is Linisol | AstraZeneca | 352 1206 | Local anesthetic for the skin |
| Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment | To prevent drying and infection of eyes | ||
| Coelenterazine | Prolume (Nanolight) | NF-CTZ-FB | Light sensitive agent (must be kept in the dark) |
| Iodine isopropanol (1%) | 3M™ DuraPrep™ | Disinfectant for the skin | |
| 0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol. | Cedium | Disinfectant for the skin | |
| Equipment | |||
| Cell counting chamber | |||
| Insulin syringes (0.3 ml) | Terumo Myjector 29G | 324826 | For injection of coelenterazine |
| Electric razor | For small animals | ||
| Sterile surgical tools | Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel | ||
| Heating pad | Leica | 14042321474 | |
| Skin suture | Johnson&Johnson | K890H | Surgical thread, needle |
| Water bath sonicator | Branson 2210 | ||
| BLI camera (IVIS Spectrum) | Perkin Elmer, Alameda | IVISSPE | |
| Living Image software | Perkin Elmer, Alameda | (version 4.2) |
References
- Yapar, N. Epidemiology and risk factors for invasive candidiasis. Ther Clin Risk Manag. 10, 95-105 (2014).
- Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofims and the host: models and new concepts for eradication. Int J Microbiol. 2012, 845352 (2012).
- Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiol. 8 (10), 1325-1337 (2013).
- Mathé, L., Van Dijck, P. Recent insights into Candida albicans biofilm resistance mechanisms. Curr Genet. 59 (4), 251-264 (2013).
- Kucharíková, S., et al. Activities of systematically administered echinocandins against in vivo mature Candida albicans. biofilms developed in a rat subcutaneous model. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2365-2368 (2013).
- Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob Agents Chemother. 46 (6), 1773-1780 (2002).
- Ramage, G., et al. Liposomal amphotericin B displays rapid dose-dependent activity against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2369-2371 (2013).
- Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
- Schinabeck, M. K., et al. Rabbit model of Candida albicans biofilm infection: liposomal amphotericin B antifungal lock therapy. Antimicrob Agents Chemother. 48 (5), 1727-1732 (2004).
- Lazzell, A. L., et al. Treatment and prevention of Candida albicans biofilms with caspofungin in a novel central venous catheter murine model of candidiasis. J Antimicrob Chemother. 64 (3), 567-570 (2009).
- Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
- Wang, X., Fries, B. A murine model for catheter associated Candiduria. J Med Microbiol. 60 (10), 1523-1529 (2011).
- Harriott, M. M., Lilly, E. A., Rodriguez, T. E., Fidel, P. L. J., Noverr, M. C. Candida albicans forms biofilms on the vaginal mucosa. Microbiology. 156 (12), 3635-3644 (2010).
- Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characerterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4, e7976 (2009).
- Ricicová, M., Kucharíková, S., Tournu, H., Hendrix, J., Bujdáková, H., Van Eldere, J., Lagrou, K., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiol. 156, 909-919 (2010).
- Kucharíková, S., Tournu, H., Holtappels, M., Van Dijck, P., Lagrou, K. In vivo efficacy of anidulafungin against Candida albicans mature biofilms in a novel rat model of catheter-associated candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4474-4478 (2010).
- Bink, A., et al. The nonsteroidal antiinflammatory drug diclofenac potentiates the in vivo activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. J Infect Dis. 206 (11), 1790-1797 (2012).
- Van de Velde, G., Kucharíková, D., Schrevens, D., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cell Microbiol. 16 (1), 115-130 (2014).
- Van de Velde, G., Kucharíková, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging of fungal biofilm development in live animals. Methods in Molecular Biology. 1098, 153-167 (2014).
- Gahan, C. G. The bacterial lux reporter system: applications in bacterial localisation studies. Curr Gene Ther. 12 (1), 12-19 (2012).
- Doyle, T. C., Nawotka, K. A., Kawahara, C. B., Francis, K. P., Contag, P. R. Visualizing fungal infections in living mice using bioluminescent pathogenic Candida albicans strains transformed with the firefly luciferase gene. Microb Pathog. 40 (2), 82-90 (2006).
- Enjalbert, B., et al. A multifunctional synthetic Gaussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections. Infect Immun. 77 (11), 4847-4858 (2009).
- Mosci, P., et al. A novel bioluminescence mouse model for monitoring oropharyngeal candidiasis in mice. Virulence. 4 (3), 250-254 (2013).
- Van Wijngaerden, E., et al. Foreign body infection: a new rat model for prophylaxis and treatment. J. Antimicrob. Chemoth. 44 (5), 669-674 (1999).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr. Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
