Summary

Generación de células T humanas aloantígeno-específicos de la sangre periférica

Published: November 21, 2014
doi:

Summary

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Abstract

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

Introduction

Los linfocitos T son componentes críticos del sistema inmune adaptativo. Las células T son responsables de mediar no sólo directamente respuestas inmunes protectoras a los agentes patógenos a través de una variedad de mecanismos efectores, sino también mantener activamente la auto-tolerancia inmunológica y dirigir las respuestas de otras células en el sistema inmune. Estas funciones están dirigidas a través de un número de señales integradas, incluyendo receptores de células T (TCR) de la ligación, citocinas y quimiocinas, y los metabolitos 1. De estas señales, el TCR es de particular importancia, ya que proporciona la especificidad característica que define el papel de la célula T en la inmunidad adaptativa. Un TCR interactúa con antígenos peptídicos lineales presentados por MHC (HLA ortólogo humano) moléculas (complejos pMHC) de una manera altamente específica y sensible para proporcionar las señales que inician la función efectora de células T. Los parámetros bioquímicos de las interacciones de TCR con ligandos pMHC proporcionan no sólo la especificidad para Tactivación de las células, sino que también tiene un impacto cualitativo en función de la célula posterior T2. Por lo tanto, el estudio de la función de las células T a menudo requiere el examen de las respuestas de las células T clonales con especificidad antigénica definida.

El compartimiento humana de células T, que contiene aproximadamente 10 12 células T αβ, contiene un estimado de julio 10 a agosto 10 αβTCRs distintas 3-4. Este diverso repertorio ofrece oportunidad para el reconocimiento de la gran variedad de péptidos de patógenos potenciales que requeriría una respuesta de células T para la inmunidad protectora. Se estima que la frecuencia de células T en respuesta a un antígeno extraño dado presentado por auto-MHC es del orden de 10 -4 a 10 -7 en ausencia de respuesta inmune antes de que el antígeno 5. El repertorio de células T naive está determinada por la selección tímica para asegurar la capacidad de reconocer auto-MHC presentación de antígenos peptídicos y límite reaccionanividad contra antígenos auto-péptido, la maximización de la utilidad potencial para mediar la inmunidad protectora 2. Sin embargo, en violación de esta diseñado reactividad, una frecuencia relativamente grande, 10 -3-10 -4, de las células T de individuos inmunológicamente ingenuos responder a la estimulación con células alogénicas, reconociendo tanto las moléculas MHC extranjeros así como los péptidos endógenos que presentan 6. El reconocimiento de ligandos pMHC alogénicos es estructuralmente similar al reconocimiento de antígenos extraños presentados por auto-MHC; el TCR hace interacciones bioquímicas críticos tanto con la molécula MHC alogénico, así como el péptido presentado 7. La naturaleza robusta de la respuesta de las células T alogénicas a resultados de la estimulación de la diversidad de los complejos pMHC presente en la superficie de las células alogénicas 8. Se estima que cada MHC presenta aproximadamente 2 x 10 4 diferentes antígenos peptídicos endógenos 9. Este breadth de la respuesta a la estimulación alogénica es un aspecto significativo de la patología clínicamente relevantes, tales como el rechazo de aloinjerto o enfermedad de injerto contra huésped (EICH), como resultado de alorreactividad de células T.

Estudio de células T respuestas alorreactivas humanos se ha basado tradicionalmente en el examen de las respuestas policlonales de células T vírgenes después de la estimulación con células alogénicas. La estimulación repetida con la misma línea celular alogénico combinado con análisis de dilución limitante es capaz de generar células T clonales con el reconocimiento alogénico HLA definida de 10. Sin embargo, este enfoque es problemático para el examen de las respuestas a ligandos pMHC alogénicos individuales, como el repertorio amplio y diverso de complejos pMHC endógeno presente durante un determinado alogénico HLA estimula un amplio repertorio de células T. Esta estimulación población mayor y la limitación de la dilución enfoque requeriría de cribado de un gran número de clones para aislar células T con la deseada Reactividad contra un único ligando pMHC. Además, la frecuencia de células T que responden a un ligando pMHC alogénico individual es relativamente baja entre las poblaciones de células T ingenuas, que presenta una barrera para la generación eficiente de clones de células T humanos que responden a un antígeno dado.

La identificación y el aislamiento de las células T específicas de antígeno de las poblaciones policlonales se han habilitado por el desarrollo de fluoróforo marcado pMHC multímeros 11. Este enfoque utiliza antígenos peptídicos específicos cargados en moléculas MHC solubles biotiniladas recombinantes, que se etiquetan mediante la unión a un fluoróforo marcado con estreptavidina. La multimerización de pMHC aumenta la avidez, la compensación de la afinidad del TCR intrínsecamente baja (M) para ligandos solubles pMHC. Las células marcadas pueden ser identificados y aislados por citometría de flujo. Sin embargo, este enfoque todavía está limitado por la baja frecuencia de células T específicas de antígeno entre las poblaciones de células T vírgenes, que son típicamenteórdenes de magnitud menor que el límite de la identificación y la cuantificación precisa en la mayoría de los citómetros de flujo. Para abordar esta limitación, un método de etiquetado tetrámero pMHC y posterior enriquecimiento perla magnética para las células tetrámero marcado ha sido desarrollado 12. Este método ha demostrado una detección fiable, enumeración, y el aislamiento de células T específicas de antígeno de baja frecuencia.

Este protocolo describe un protocolo eficaz para la generación de clones humanos de células T que responden específicamente a ligandos pMHC alogénicos individuales. El protocolo se aplica pMHC (HLA) etiquetado multímero y enriquecimiento para el aislamiento de células T humanas-aloantígeno específico con citometría de flujo de células de clasificación y un método robusto para el cultivo in vitro de células T humanas para permitir la producción de clones de células T de células clasificadas individuales ( visión general en la Figura 1).

Protocol

NOTA: Este protocolo requiere el uso de muestras de sangre periférica de voluntarios humanos. Todas las investigaciones con seres humanos debe ser revisado y aprobado por un Estudios Humanos Junta de Revisión Institucional para garantizar el cumplimiento de la Declaración de Helsinki (2013) y la Portabilidad del Seguro de Salud y la Ley de Responsabilidad de 1996. 1. Aislamiento de células T de sangre entera Antes de comenzar, calentar el medio de gradiente de densidad a tempe…

Representative Results

Este protocolo describe la generación de cultivos de células humanas T clonal con aloantígeno especificidad definida a través de un enriquecimiento de perla magnética y flujo de una sola célula de clasificación de citometría de estrategia. La Figura 1 proporciona un esquema del proceso. Figura 1: Visión general de Protocolo El protoco…

Discussion

T cell alloreactivity is a long-studied and clinically-relevant phenomenon. The robust proliferative and effector responses of T cells to allogeneic stimulation has enabled extensive analyses of human T cell responses in vitro through relatively straightforward mixed lymphocyte reactions of peripheral blood T cells against inactivated allogeneic cells. However, these primary alloreactive T cell responses are oligoclonal, comprised of a large number of individual T cells responding to specific alloantigens. This …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The author would like to thank the NIH Tetramer Core Facility for tetramer production. The author would also like to thank E.D. O’Connor and K.E. Marquez at the UCSD Human Embryonic Stem Cell Core Facility flow cytometry laboratory for assistance in cell sorting. This work was funded by National Institutes of Health grant K08AI085039 (G.P.M.).

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Sodium heparin venous blood collection tube 16 x 100 mm Becton, Dickenson and Company 366480
Lymphoprep Stemcell Technologies 7801
Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit Stemcell Technologies 15061
Dulbecco's PBS, 1x without Ca or Mg Corning 21-031-CV
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906
EDTA Sigma-Aldrich E6635
Fluorophore-labeled pMHC tetramer NIH Tetramer Facility NA
EasySep Biotin Selection Kit Stemcell Technologies 18553
EasySep Selection magnet Stemcell Technologies 18000
TruStain FcX Human Fc blocking solution Biolegend 422301
Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2) Biolegend 300621
Anti-CD14 FITC (clone HCD14) Biolegend 325603
Anti-CD19 FITC (clone HIB19) Biolegend 302205
Iscove's DMEM, without b-ME or L-glutamine Corning 15-016-CV
HEPES Corning 25-060-CI
b-Mercaptoethanol  Life Technologies 21985-023
Glutamax Life Technologies 35050061
Gentamicin sulfate (50 mg/ml) Omega Scientific GT-50
Human AB serum, male donor Omega Scientific HS-30
Recombinant human IL-2 Peprotech AF 200-02
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 Life Technologies 11131D
Media
Cell sorting buffer
PBS, pH 7.4 1 L
BSA 10g
EDTA (0.5 M) 2 ml
Human T Cell Culture Medium
Iscove's DMEM 351.6 ml
Heat-inactivated human AB serum 40 ml
HEPES (1 M) 4 ml
Glutamax (100 x) 4 ml
Gentamicin (50 mg/ml) 0.4 ml
b-mercaptoethanol (14.3 M) 1.4 ml
Recombinant human IL-2 (1 mg/ml) 1 ml

References

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Citer Cet Article
Jama, B. P., Morris, G. P. Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (93), e52257, doi:10.3791/52257 (2014).

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