引物对免疫冰冻切片大鼠脑组织：例为染色小胶质细胞和神经元
Summary
This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.
Abstract
免疫组织化学是一种广泛使用的技术，用于检测的存在，位置和相对原位抗原的丰度。这个入门级协议说明了试剂，设备和完成啮齿动物的脑组织的免疫组织化学染色所需的技术，使用标记的小胶质细胞和神经元的元素作为一个例子。具体地，本文是一步一步的协议，用于小胶质细胞和神经元的通过免疫组织化学对Iba1和泛神经元，分别荧光可视化。荧光双标记是用于在同一样品中多种蛋白的定位是特别有用的，提供的机会，以准确地观察细胞类型，受体，配体之间的相互作用，和/或细胞外基质中相对于彼此以及蛋白质共单个细胞内的定位。不像其他的可视化技术，荧光免疫组化染色强度可能减小在几个星期到几个月之后染色，除非有适当的预防措施。尽管这种限制，在许多应用荧光双标记优于替代品，如3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）或碱性磷酸酶（AP），由于荧光是更多的时间效率，并允许两个或更多个之间更加精确的分化标记。讨论包括故障排除提示和建议，以促进成功。
Introduction
免疫组织化学是用于通过使用特异性结合到感兴趣的抗原的第一抗体检测抗原（ 即蛋白）的组织切片的方法。免疫组化法开创的JR马拉克在1934年，当他确定抗体可与很大的特殊性1本地化抗原。在1942年开始，一些先在体外用荧光抗体可视化免疫研究发表2,3，此后，第一体内组织化学研究发表4。在20世纪60年代，经过三十年的免疫组化方法以来，酶标记的抗体开始被用作辅助试剂。这些方法同时并独立开发了法国和美国5,6。如今，抗体的广泛提供了无限的可能性，免疫组化研究7。
“>此对应的总体目标是提供一个简单的介绍到免疫组化染色;它并不意味着是该技术的全面和详尽的审查中列出的方法，免疫组化技术对两种抗原呈现（标记为小胶质细胞和。神经元），用于多聚甲醛的染色灌注，蔗糖冷冻保护，冰冻切片大鼠脑。免疫组织化学染色开始阻断非特异性抗原结合，以减少背景染色。接着，温育与初级抗体允许在组织结合到特定抗原。继第一抗体，另一种抗体，称为二次抗体，被施加到第一抗体链接到一个共轭可视信号8。二级抗体靶向免疫球蛋白G（IgG）的特定于其中初级抗体升高的物种域。二级抗体放大该信号第一抗体的自吨的Fab区他的第二抗体结合到多个站点上的第一抗体的抗体结构域。或者缀合到二级抗体的F c的区域的酶或荧光分子使可视化。例如，兔抗Iba1第一抗体是特异性针对Iba1兔IgG分子。当驴抗兔IgG被作为二次抗体施加，它会识别和结合的兔抗Iba1 IgG抗体的多个区域（ 见图1）。驴抗体可通过各种方法来显示。这种对应着重于检测缀合到二级抗体，其识别第一抗体，用于可视化通过荧光显微镜荧光团。在荧光免疫组织化学，核染色剂如Hoechst的或DAPI可以用于可视化的所有核。
图1：SCH的直接与间接的抗体标记技术ematic表示。抗体结合到感兴趣的抗原，并且可以通过产生针对第一抗体的物种的二级抗体进行放大。这种技术可以使用抗生物素蛋白-生物素复合物（ABC）用于扩增和DAB进行可视化（A）中进行，或直接缀合的荧光第二抗体（B）。另外，主要的抗体可直接偶联与许多不同的标记，包括生物素或荧光团（C）。 请点击此处查看该图的放大版本。
对于免疫组织化学染色的可视化的另一种方法是使用3,3'-二氨基联苯胺四盐酸（DAB;参见图1和2）。这不同于荧光通过使用生物素化的或辣根过氧化物酶（HRP）缀合的第二抗体，其提供了一种酶的DAB转换为沉淀物是在亮视野显微镜可见。中的实例，其中一个单一的抗原是感兴趣或染色需要是持久的，DAB可能比荧光染色更合适。然而，DAB染色并不非常适合于多个标记之间的差异，特别是如果两个核抗原的兴趣。关于DAB材料和协议修改的信息，请参阅表1中 。另外，硝基蓝四唑氯化物/ 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（NBT / BCIP）可以被用于可视化的碱性磷酸酶（AP）缀合的二抗体。
图2：镍增强的DAB单标记的大鼠脑组织切片的代表性图像大鼠脑瑟ctions其上标有镍增强DAB的Iba1（A）和泛神经元（B）允许单独或小胶质细胞神经元的长期分析。比例尺20微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
必须考虑的组织内感兴趣的抗原的估计的丰度的分析处理。间接的方法（如上所述）可用于具有低丰度的目标是有用的。当感兴趣的抗原是在高丰度，直接的方法都可以应用。直接方法涉及一个直接缀合到一个可视信号的初级抗体，因此没有第二抗体是必需的。此方法简化了染色处理，但消除了间接的方法取得的扩增。使用直接缀合的初级抗体也消除交叉反应的第二抗体的当双标记。
该通信详细介绍了协议双标记与Iba1和泛神经元（ 如表1的细节）。 Iba1小胶质细胞染成许多活化状态，包括分枝，超分枝，激活，变形虫，和杆。泛神经污渍神经轴突，树突和索玛。因为Iba1渍最小胶质细胞和泛神经元靶神经元，污渍的这种组合中获得的小胶质细胞 – 神经元相互作用的广泛了解。
总之，免疫组化染色依赖于精心挑选的抗体。随着研究的问题变得更加具体，提出的到备用抗原抗体可能不理想。要针对特定的小胶质细胞激活状态，可以选择使用CD45或CD68抗体，而不是Iba1。此外，与小鼠的工作，F4 / 80可提供必要的结果。同样地，神经元元件可特异性地与抗体ラ针对性反对核ISED，突触（前或后），轴突和生长锥。此外，还有其他的标志物区分神经元（双肾上腺皮质激素，的NeuN）的年龄和神经再生（GAP-43）。
Protocol
Representative Results
Discussion
这种沟通的总体目标是引进免疫程序给读者。为此，双标记与Iba1和泛神经元抗原的例子来观察小胶质细胞和多聚甲醛中的神经元灌注，蔗糖冷冻保护，冰冻切片大鼠脑使用。
这种技术可以适用于服务无休止的目的。不同抗原在多种组织类型，例如但不限于脑，肺，肝，肾和肠的阵列可以免疫组织化学与小幅调整协议被可视化。免疫组织化学允许的多个标记的直接比较，并且?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Mr. Ryan Hart and Mr. Arriz Lucas for their invaluable feedback on this communication. This work was supported by NIH NINDS R01 NS065052 and Phoenix Children’s Hospital Mission Support Funds.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides | Fisher Scientific | 22-034-979 | Used for tissue mounting (1.2.2) |
| Oven | Thermo Scientific | 51028112 | Used for tissue drying (2.1.1) |
| Mini Pap pen | Life Technologies | 00-8877 | Used in step 2.2.2 |
| Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish | Fisher Scientific | 22-149-429 | Used for all washes during staining (2.2), as well as the Hoechst step (2.2.8) |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Used for drying slides (2.2) |
| Black Staining Box | Ted Pella | 21050 | Used for blocking and staining steps (2.2) |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | 50-413-253 | Used for block and antibody incubation (2.2) |
| Mouse α-Pan-neuronal | Millipore | MAB2300 | Used for primary antibody (2.2.4) |
| Rabbit α-Iba1 | Wako Chemical | 019-19741 | Used for primary antibody (2.2.4) |
| Donkey α-Rabbit 594 | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | Used for secondary antibody (2.2.6) |
| Donkey α-mouse 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Used for secondary antibody (2.2.6) |
| Caterer's foil | Any | N/A | Used in steps 1.2.2 and 2.3.2 |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Used for coverslipping (2.2.8) |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | Used for coverslipping (2.2.8) |
| Clear Nail Polish | Any | N/A | Used for coverslipping (2.2.8) |
| Axio Observer.Z1 and LSM 710 (laser scanning, confocal) | Carl Zeiss | N/A | Used for imaging (3) |
| Axioskop A2 | Carl Zeiss | N/A | Used for imaging (3) |
| CitriSolv | FisherScientific | For DAB protocol | |
| ABC | Vector Laboratories | PK-6100 | For DAB protocol |
| DAB Peroxidase kit | Vector Laboratories | SK-4100 | For DAB protocol |
| Biotinylated horse α-rabbit IgG | Vector Laboratories | BA-1100 | For DAB protocol |
| Biotinylated horse α-mouse IgG | Vector Laboratories | BA-2001 | For DAB protocol |
| 30% Hydrogen Peroxide | FisherScientific | H325-500 | For DAB protocol |
| Wheaton slide racks and staining dishes | TedPella | 21043 | For DAB protocol |
| Masterflex perfusion pump and tubing | Cole-Parmer | Used for perfusion (1.1.1 and 1.1.2) | |
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used for tissue freezing (1.2.1) |
| Thermometer (-50 to 50 C) | Fisher Scientific | 15-059-228 | Used for tissue freezing (1.2.1) |
| Cryostat | Leica | CM3500S | Used for tissue sectioning (1.2.2) |
| Staining Dish, Plastic with 2 Lids | Grale Scientific | 353 | For antigen retrival |
| 20 Place Staining Rack, Slides Horizontal | Grale Scientific | 354 | For antigen retrival |
| Microwave | Any | N/A | For antigen retrival |
References
- Marrack, J. R. Chemistry of antigens and antibodies. Nature. 134, 468-469 (1934).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. J Immunol. 45, 159-170 (1942).
- Marshall, J. M. Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods. The Journal of experimental medicine. 94, 21-30 (1951).
- Mellors, R. C. Histochemical demonstration of the in vivo localization of antibodies: antigenic components of the kidney and the pathogenesis of glomerulonephritis. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 3, 284-289 (1955).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
- Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. Comptes rendus hebdomadaires des seances de l’Academie des sciences. Serie D: Sciences naturelles. 262, 2543-2545 (1966).
- Cuello, A. C. . Immunohistochemistry. , (1983).
- Junqueira, L. C. U., Mescher, A. L. . Junqueira’s basic histology : text and atlas. , (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Christensen, N. K., Winther, L., Kumar, G. L., Rudbeck, L. . Education Guide: Immunohistochemical (IHC) staining methods. , 103-108 (2009).
- Wang, G., Achim, C. L., Hamilton, R. L., Wiley, C. A., Soontornniyomkij, V. Tyramide signal amplification method in multiple-label immunofluorescence confocal microscopy). Methods. 18, 459-464 (1999).
- Feldengut, S., Del Tredici, K., Braak, H. Paraffin sections of 70-100 mum: a novel technique and its benefits for studying the nervous system. Journal of neuroscience methods. 215, 241-244 (2013).
