This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.
Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules.
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules.
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.
המטרה של cryoEM היא להשיג תמונות מיקרוסקופיות אלקטרונים של מקרו-מולקולות במצב התייבשות האם שלהם. מכוח הטבעת מקרומולקולה במים מזוגגים, מדגם קפוא hydrated יכול להיות הציג ישירות ומדמיין במכשיר TEM. Vitrification, השיג הבזק הקפאה (10,000 C / sec o) על ידי, מקפיא את המדגם מבלי התגבשות מים ומבטיח כי ארגון מחדש מולקולרי במהלך ההקפאה הוא חסרי משמעות. העודף של פיזור אלקטרונים של המדגם ביחס לחיץ סביב מספק ניגוד קטן אבל מספיק לראות את מקרומולקולה בהעדר כל כתם 1. עיבוד תמונה ממוחשב לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לשחזר מבנה 3D של מקרומולקולה. מקרו-מולקולות גדולות בטווח ~ 500 מד"א הרב kDa- הן דוגמאות אידיאליים עבור cryoEM (המייצגות למעלה מ- 80% מהגדה נתונים מיקרוסקופית אלקטרונים (EMDB) כניסות); אלה כוללים חלבונים, קומפלקסי חלבונים, חלבון חומצות גרעין גomplexes, וחלבוני קרום משובצים בbilayer. מקרו-מולקולות אלה הם פחות סיכוי להיות מגובש (עם פחות מ -2% ערכים במסד נתוני PDB) עדיין זה קורה לעתים קרובות שחתיכות קטנות יותר לפתרון על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן או NMR ניתן לעגן למעטפת 3D נוצרה על ידי cryoEM. מצד השני, חלק מהמבנים הגדולים ביותר נפתרו על ידי cryoEM ניתן לזהות בתוך התא המלא בסעיף דק TEM 2. לפיכך, cryoEM יעילות מגשר על הגודל ורזולוציה הפער בין מבני subcellular והאטומיים.
CryoEM משקף מבנה טוב יותר של מקרומולקולה ילידים מאשר בשיטה הקלאסית יותר של מכתים שלילי (NS), שבו מקרומולקולה מיובש ומוקף בשכבה של כתם מתכת כבד לפי אזור הדרת כתם יוצר תמונה מאוד בניגוד "שלילית" 3. בשני המקרים אלומת האלקטרונים מפיקה תמונות 2D השלכה של מקרו-המולקולות, חלקיקים הנקראים, שבו יםhape תלוי בכיוון של מקרומולקולה ביחס לאלומת האלקטרונים. חלקיקים רבים, לפחות ~ 1000 וללא גבול עליון, ניתן לנתח במחשב עם 'ניתוח יחיד חלקיקים "(SPA) תוכנה כדי להגדיל את יחס האות לרעש (SNR) אם כי מיצוע, ולמצוא פרמטרים ההתמצאות במרחב של החלקיקים צורך לשחזר 3D המבנה של הפולימר מצוי על ידי 4-7 הקרנה אחורית. NS, עם יחס אות לרעש גבוה יותר, משמש לאפיון מדגם ראשוני וליצור דה נובו שחזור 3D; הרזולוציה שלה לעתים רחוקות עולה על 20 א ', שמוטל על ידי ההתייבשות והגודל של גרגר המתכת הכבד. באופן כללי, לקביעה מבנית cryoEM 3D, שחזור 3D ברזולוציה נמוכה מתקבל ראשונה מNS ולאחר מכן cryoEM משמש כדי לחדד את המפה ראשונית ברזולוציה נמוכה זה כדי ללמוד עוד מקרומולקולה במדינת hydrated המקורי שלו, כדי לראות את המבנה הפנימי שלה, וכדי להגדיל את הרזולוציה שלה. לאte שאם מודל NS היה מעוות (הדוגמא הנפוצה ביותר היא ההשטחה כתוצאה מהתייבשות 8) והיו לי חלקיקי cryoEM SNR הנמוך, אז העיוות יכולה לשאת לתוך מודל cryoEM (חפץ המודל-משוא פנים, שהוא נפוץ בSNR הנמוך מערכי נתונים 9). עיוות מבנית תביא לחוסר התאמה בין NS וחלקיקי גלם cryoEM ובין חלקיקי cryoEM גלם והתחזיות מקבילה של מודל 3D מאונך לכיוון השיטוח. הטיה דגם עשויה לפתור בעצמו כמודל 3D עובר מחזורים רצופים עידון. צריך שלא יתרחש, שיזוהה כחוסר התאמה בין חלקיקי גלם cryoEM ותחזיות המקבילה ממודל 3D, אז מודל דה נובו צריך להיות בנוי מנתוני cryoEM. גישה טובה יכולה להיות לשימוש באלגוריתם הזוויתי הכינון מחדש 10, אשר עשוי להניב כמה כרכי 3D אפשריים, ולאחר מכן להשתמש במודל NS 3D כדי לבחור את מודל cryoEM הטוב ביותר האפשרישיהיה מעודן 11 נוסף. אסטרטגיה אפילו טובה יותר היא להגדיל את יחס האות לרעש של בסיס נתוני cryoEM (ראה סעיף ייעודי בדיון).
יש האיכות ביוכימיים של מקרומולקולה המטוהר השפעה מירבית בתוצאה הסופית. מקרומולקולה, מטוהר מרקמות או באו לידי ביטוי במערכות Heterologous, צריך להיות ברמה גבוהה של טוהר ולהיות מבני בשלמותה. זה צריך לא ליצור אגרגטים ולא צריך את זה disaggregate. כדי להגדיר קונפורמציה מסוימת, תנאי ההכנה צריכים לקדם מדינת קונפורמציה אחידה. ללמוד מתחמים, זה אופטימלי שD k הוא בטווח ננומטר, אחרת fixatives שימש בהצלחה לייצוב אינטראקציות זיקה נמוכה 12,13.
תמונות cryoEM לא מעובדות להניב מידע רב ערך על הממדים, קווי המתאר כלליים, מצב צבירה / multimerization, הומוגניות, ומבנה פנימי של macromolecule. אף על פי כן את הפוטנציאל של הטכניקה הוא משופר בהרבה עם עיבוד תמונה. מבנה 3D מגלה ארכיטקטורה הכוללת של מקרומולקולה, מיקום 3D של הליגנדים ויחידות משנה, שינויי קונפורמציה, ומאפשר עגינה של מבנים אטומיים נקבעו על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן או NMR. כמות המידע של שחזור 3D מגדילה בשלבים כפי שהרזולוציה גדלה: ברזולוציה גנרל 15-20 מאפשרת עגינה חד-משמעית של מבנים אטומיים, ב9-10 סלילי אלפא נראה כמוטות, בשעה 5 Å ניתן להבחין גיליונות בטא, ובהחלטות של 3.5 ויותר טובים שאפשר לבנות מודל אטומי 14.
האפשרות לקבל תמונות אינפורמטיבי ושחזור 3D באמצעות SPA מכמויות קטנות יחסית של מדגם לעשות cryoEM טכניקה אטרקטיבית, כמו 3-5 μl של לפחות 0.05 מ"ג / מיליליטר מספיקים כדי להכין את רשת TEM אחד. דרישות מינימום אינסטרומנטלילcryoEM הם cryo-בוכנת תוצרת בית או מסחרי, מיקרוסקופ אלקטרונים עם ואקום גבוה במיוחד, תקשורת הקלטת תמונה וערכה במינון נמוך, cryo-בעל עם תחנת השאיבה שלו, מנגנון הפרשות זוהרים, ומאייד. תכונות שאינן חיוניות, אך רצויות נוסף על TEM הן מצלמת CCD (קיים בכל TEMs המודרני) או גלאי אלקטרונים ישירים, אקדח פליטת שדה (FEG), סינון אנרגיה, ותוכנה לאיסוף נתונים תפוקה גבוהה. תוכנה בעיקרון זה מאפשרת איסוף עשרות אלפי חלקיקים במושב cryoEM יחיד 15, אולם לצרכי אחסון נתונים המוגבר וצורך זמן שלאחר עיבוד בפיקוח לאחר להילקח בחשבון. FEG בשילוב עם פונקצית העברה בניגוד תיקון (CTF) עומד בבסיס רוב שחזורי 3D שהגיעו רזולוציה מספיקה כדי להמחיש סלילי אלפא. בשלב זה, את רמת הרזולוציה היא גם מדגם תלויה: הגיע 10 רזולוציה A הוא פחות נפוצה לחלבוני קרום ואילו אםסדר גבוה של סימטריה קיים אז הרזולוציה אטומית היא ברת השגה יותר. הפיתוח האחרון של גלאי אלקטרונים ישירים אפשר רזולוציה אטומית אפילו למקרו-מולקולות עם סימטריה נמוכה (4x) או לא, שבו האיכות של מפות צפיפות האלקטרונים cryoEM תואמת נגזרים אלה מנתוני רנטגן עקיפה 16,17.
דוגמאות מעשיות הממחישות את היכולות של הטכניקה מובאות כאן כארבעה סוגים חשובים של מקרו-מולקולות שבי cryoEM יש תפקיד ראשי בהמשך הנחישות המבנית שלהם. (I) עם הסימטריה icosahedral שמגדילה את בסיס הנתונים של פי 60 וגודל שלהם גדול המאפשר נאמן ויישור לשחזור, המבנים של כמה וירוסי icosahedral נפתרו לרזולוציה כמעט אטומית על ידי cryoEM אחרי SPA 18. אנחנו מראים דוגמא של כיתה של וירוסי icosahedral, adeno הקשורים וירוסים (AAVs), שלמבנים ליד-אטומיים על ידי cryoEM ועל ידי HY / רנטגן cryoEMשיטות Brid קיימות 19,20. (Ii) מקרומולקולות עם מבנה סליל כוללת microtubules, חוטים ווירוסים. יחידות החוזרות על עצמן לאורך ציר הסליל יכולות להיות מנותחות על ידי גרסה מורכבת יותר של SPA המותאם לגיאומטרית הסליל 21. בדוגמא שאנו מציגים וירוס טבק פסיפס (TMV), וירוס RNA שנפתר לרזולוציה אטומית על ידי 22 cryoEM. (Iii) חלבונים מסיסים גדולים נחקרו בשפע. בין אלה, מקרו-מולקולות ויוצרות גלילי Multimeric סימטריים מהוות ארכיטקטורה חוזרת לעתים קרובות לפתור ברזולוציה subnanometer 23,24. כאן אנו מראים תמונות של KLH, מוביל חמצן חסר חוליות, שבו מודל מולקולרי היברידי נוצר משיטות היברידיות קריסטלוגרפיה cryoEM / רנטגן 25. (Iv) חלבוני ממברנה הם מעמד חשוב של חלבונים; הם מהווים כ- 1/3 מהחלבונים מקודדים על ידי הגנום האנושי, אך הם קשים לאפיון מבני בשל מורכבות הקשורים trייצוב ansmembrane תחום 26, ומהווה פחות מ -1.5% מהמבנים נפתרו על ידי כל טכניקה מבנית בשילוב. התפקיד של שיקום cryoEM ו3D בנחישות המבנית שלהם בא לידי ביטוי עם קולט ryanodine (RyR), Ca 2 + ערוץ תאיים אוקריוטים גדול חשוב בהתכווצות שרירים ואיתות המוח. מבני cryoEM הרזולוציה הגבוהים ביותר עד כה, עם 10 רזולוציה Å, לחשוף מבנה משני 27.
TEM ואחרי SPA תרם רבים מבני 3D macromolecular, מתקרב 2,000 ערכים בEMDB עד אמצע 2014. באופן כללי, למקרומולקולה נתון, מבנה 3D ברזולוציה נמוכה נקבע תחילה מנתוני NS, אשר עשוי להיות מלווה גבוה יותר מבנה הרזולוציה cryoEM 3D. ניגודיות הגבוה של הגבולות המולקולריים הניתנים על ידי NS, המאפשר שחזור 3D הראשון, הוא מעודן מאוחר יותר על ידי cryoEM עם יכולתה כדי למפות את המבנה הפנימי של הפולימר מצוי במצב התייבשות המלאה שלה, וכן את האפשרות להגיע לרזולוציה גבוהה הרבה יותר. יתרון נוסף של cryoEM הוא החיסול של מתח התייבשות שעלולה לגרום לקריסה של מקרומולקולה. בנוסף, קיים האפשרות להשמיט את תמיכת פחמן, אשר מבטלת השפעות קליטת משטח אפשרי ומציגה את קונפורמציה שמקרומולקולה מאמץ בפתרון. צביעת קריו שלילית, שילוב של cryoEM וNS, מעניקה ניגודיות גבוהה בhyd מלאדירוג דגימה וגם יכול להוביל לשחזור 3D באמצעות SPA, אולם זה כבר נעשה שימוש בתדירות נמוכה יותר, עם פחות מ -10 ערכי EMDB, בין שאר משום שהכתם עצמו עלול להפריע לשלמות מקרומולקולה 31. שתי טכניקות TEM אחרות תורמים לשחזור 3D הן קריסטלוגרפיה אלקטרון 2D וטומוגרפיה של האלקטרון. קריסטלוגרפיה אלקטרון 2D דורשת גביש מישוריים או צינורי; התאבכות האלקטרונים של הגביש המשמשת לשחזור 3D שעלול לגרום לרזולוציה אטומית 32. בטומוגרפיה של האלקטרון של דגימות קבועות מזוגגות או מסורתיים, מרכיב מקרומולקולה או תת-תאי הוא הסתובב בתוך TEM לשיקום טומוגרפית הבא 33, עם היתרון שניתן לשחזר אובייקטים ייחודיים; עם זאת כיום בטכניקה זו יש מגבלת רזולוציה נעה 40-20 Å 34,35. בין כל טכניקות TEM מולקולריות אלה, SPA של נתונים NS וcryoEM היה נרחב ביותרבשימוש. הפרוטוקול המאויר כאן מוקדש לקבלת תמונות cryoEM מתאימות לניתוח SPA; אף על פי כן רוב הפרוטוקול גם לגבי גבישים ודגימות טומוגרפית cryoEM של 2D.
מושב cryoEM מוצלח תלוי בהצלחה בשילובם של רבים שלבים קריטיים; היבטים חשובים לזכור, הסבר של חפצי cryoEM הנפוץ וכיצד להימנע מהם מתוארים בסעיפים הבאים. סעיף זה מתאר גם הנחיות לאיסוף נתונים להשגת שחזורי 3D באיכות גבוהה תוך שימוש בשיטת SPA.
הימנע ממעבר לצח קרח. היבט מרכזי הוא שהמדגם צריך להישאר במדינת זגוגית מרגע לאורך תצפית TEM צולל-cryo. כך לאחר ירידה חדה במדגם אתאן הנוזלי בכל הצעדים הבאים מבוצעים בחנקן נוזלי (-196 ° C) או הליום נוזלי (-269 ° C) טמפרטורות. התחממות לעיל -135 מעלות צלזיוס הופכת מים זגוגית בלמים גבישים; אז שחלופי macromolecular עשויים להתרחש וגבישי מים שולטים בתמונה (איור 3 א); המדגם צריך להיות מושלך. מדגם חימום מקרי יכול לקרות אם cryo-צולל, העברת הרשת הקפואה בין מכולות (גם אם מוגן על ידי gridbox), ו / או הכנסת בעל cryo לTEM היא איטית מדי, או אם פינצטה הטיפול היתה מספיק מראש מקורר. הרעה משמעותית בואקום TEM על cryo-העברה (אוויר הנכנס מלכודות מדגם קרות חם יותר) יכולה גם לחמם את המדגם. לבסוף, על-הקרנה של המדגם יכול גם לגרום למעבר לצח, קרח.
למזער את זיהום קרח. בהתחשב בנפח הדגימה הקטן (3-5 μl) פנה לרשת TEM, אידוי יכול להתרכז רכיבי חיץ (מלח, חומרי ניקוי) ובכך להשפיע על שלמות macromolecular לרבות אובדן מדינת Multimeric. לעקוף או מייקרו-סביבת תא לחות היחסית גבוהה (RH)של בעיה זו. לחלופין cryo-צולל ניתן לעשות זאת בחדר קר סביבתי מאוורר במידה מספקת. לאחר RH צולל-cryo צריך להיות נמוך ככל האפשר על מנת למנוע זיהום קרח, או התעבות של לחות סביבה בcryo-הרשת, כמו cryo-הרשת עצמו פועל כמלכודת קרה. זיהום קרח מורכב מחלקיקים עם ניגודיות גבוהה ולא מסד עם גדלים הנעים בין 5 ~ ננומטר וכמה מיקרונים שמפריעים או אפילו לחלוטין לחסום את התמונה. הימנע טיוטות אוויר, מדבר / נשימה לקראת cryo-הרשת במהלך העברת אוויר, ולהפחית RH הסביבה. מכולות פתוחות חנקן נוזליים עם מים תמצית (נראים כמו חלקיקים מרחפים לבנים) גם צריכה להיות מושלכות.
מקסם אוריינטציות / צפיות macromolecular. לתמיכת מדגם, בחירה להתבצע היא בין רשתות המחוררת האמיתיות ופחמן דק על רשתות מחוררות. זה תלוי ב( i) איך המדגם משתרע על פני סרט פחמן לעומת חורי פחמן, (ii) conce מדגם זמיןntration, כמו חורים חשופים עשויים לדרוש ריכוז 100X גבוה מתמיכת פחמן לצפיפות חלקיקים דומה בתמונה (מ~ 0.02-2 מיקרומטר), ו- (iii) כיצד אקראי היא ההפצה של אוריינטציות מקרומולקולה. שים לב שהפרשות זוהרת, מה שהופך את הידרופילי פחמן, תהיה לכך השפעה חשובה בכל שלושת היבטים ושזה יהיה מדגם תלוי. לגבי הכיוון של מקרומולקולה, תוך מבט חוזר רצוי לקביעה המבנית הראשונית על ידי שחזור חרוטי אקראי, אקראית דעות macromolecular רצויה בעת שיפור שחזור 3D לרזולוציות גבוהות יותר. בדוגמא שלנו, RyR1 אינטראקציה עם פחמן עם נוף אהוב "פי ארבעה" (איור 2 ד) ודורש רשתות מחוררות לאקראיות של אוריינטציות ורזולוציה גבוהה יותר 36.
למקסם את יחס אות לרעש. האסטרטגיה הטובה ביותר כדי להגדיל את יחס האות לרעש הוא להפחית את מקורות רקע של רעש. קרח מוגזםעובי ו( אם קיים) עובי סרט פחמן מעבר למה שנדרש כדי לתמוך ולהטביע את החלבון יוסיף רעש נוסף. כך עובי קרח צריך להיות מופחת למינימום הנדרש על ידי שליטה בזמן, לחץ, RH, ואיכות נייר סינון סופג. לתמיכת פחמן, (~ 5 ננומטר) סרט פחמן דק מונח על פני סרט פחמן המחורר העבה: פחמן המחורר העבה מספק התנגדות מכאנית ואילו המדגם צילם מעל החור מכוסה פחמן הדק. מצד השני, שימו לב שמאוד קרח דק ו / או פחמן עלולה לגרום לתמיכה נשברה בקלות שיכול להפוך לאינטרנט (איור 3D). על מנת למקסם את יחס האות לרעש, יש להימנע בכל רכיבי חיץ מיותרים. לחלבוני קרום, חומרי הניקוי לוקח אגרה משמעותית על ניגוד (ראה איור 2 ד, פנל מימין). בנוסף על ידי הפחתת מתח פן חומר הניקוי משנה את האופן שבו המדגם מתפשט על התמיכה. חלבוני קרום מסוימים דורשים נוכחות של שומנים בדם, בנוסף לDetergent, אשר מפחית את הניגוד נוסף. כדי להתגבר על זה המדגם יכול להיות מדולל בחיץ עם ריכוז חומר ניקוי נמוך יותר וללא שומנים רק לפני cryo-צולל 37. חומרי ניקוי חדש חלופי 16 והשימוש בnanodisks 38 כדי לייצב את מרכיב תחום הטרנסממברני נראים גישות מוצלחות לחלבוני קרום הדמיה על ידי cryoEM.
לשאוף לתמונות באיכות גבוהות ולהתכונן לתיקון CTF. מזוגגות דגימות דורשות ערכי defocus גבוהים כדי ליצור תמונה מספיק (שלב) לעומת זאת יש בי CTF, הפונקציה המתייחסת עוצמה לתדר, כמה אפס מעברים, ובנקודה אין מידע. בעוד תיקון CTF אין צורך לשחזור 3D ברזולוציה נמוכה, כאשר מכוונים לרזולוציה גבוהה יותר, כדי להתאושש ייצוג מדויק של אובייקט 3D, תמונות עם defoci שונה צריכה להיות שנאספו כך שתיקון CTF חישובית ניתן לעשות.נחישות CTF ותיקון כלולה בחבילות תוכנת SPA הגדולות 4-7; ניתן למצוא את פרטים במקומות אחרים 39. לתיקון CTF אופטימלי, משתמש במגוון של defoci. אסטרטגיה טובה היא להחליף בין 3-4 ערכי defocus. הערכים תלויים בגודל של מקרומולקולה (גדלים גדולים יותר דורשים פחות defocus), עובי קרח / פחמן (לדוגמא דקה יותר דורשת פחות defocus), והמתח (מתח נמוך דורש פחות defocus). עבור 200 וולט, טווח התחלה טוב של ערכים הוא 2.5, 3, 3.5 ו -4 מיקרומטר defocus. CTF בא לידי ביטוי לסירוגין טבעות של אינטנסיביות גבוהה ונמוכה (Thon מצלצל 40) בייצוג המרחב ההדדי, ספקטרום הכח. מציג את ספקטרום הכח יגלה את הפוטנציאל להחלטה; התדירות של טבעת Thon הגלוי הרחבה ביותר היא הקרובה ביותר הערכה מראש של ההחלטה ברת-השגה. ספקטרום הכח צריך להיבדק מעת לעת, וטבעות astigmatic (מעגלי שאינו) Thon (איור 3C) צריך להיות מתוקן עם stigmator האובייקטיבי. טבעות Thon צריכה להיות גלויות לפחות עד הרזולוציה הרצויה.
בסיס נתוני cryoEM שהושג באמצעות פרוטוקול זה יכול להיות מעובד ישירות על ידי SPA על מנת ליצור שחזור 3D. אפילו עם מדגם אידיאלי, איכות שחזור 3D תהיה תלויה בביצועים והמפרטים של ציוד TEM, ועל עיבוד התמונה. עם השיפורים המשיכו בשתי החזיתות הללו, ועם אזכור מיוחד לגלאי אלקטרונים הישירים שפותחו לאחרונה, את האפשרות להשיג שחזורי 3D ברזולוציה אטומית יותר באופן עקבי היא קרוב יותר ממה שהיה אי פעם.
The authors have nothing to disclose.
We thank the kind donations of AAV5 sample by Mavis Agbandje-McKenna and Antonette Bennett, and of TMV sample by Ruben Diaz. This work is supported by American Heart Association grant 14GRNT19660003 and VCU startup funds to MS.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Ethane | Airgas | 371745 | 99.99% purity very important, impurities can lead to high-contrast contaminants on the grid. CAUTION: flammable |
Liquid nitrogen | Airgas | 27135 | 99% purity. CAUTION: handling liquid nitrogen in a cold room poses a serious asphyxia hazard since nitrogen displaces oxygen without any warning signs. |
Dumont no. 5 Antimagnetic tweezers | Ted Pella | 5326 | |
Mica sheets, 1 x 4 cm | Ted Pella | 54 | |
Graphite rods, presharpened size 1/8” dia x 2 ¼” long tip 0.039” dia neck type | Electron Microscopy Sciences | 70220-45 | |
350 ml cryo-dewars | Pope | 8600 | |
Cu 400 mesh holey grids Quantifoil | Quantifoil | Q10525 | |
Cu 400 mesh holey grids C-Flat | Protochips | CF-1.2/1.3-4C | |
Glow discharge device | Electron Microscopy Sciences | Model E7620 | |
Turbo pumping station | Gatan | Model 655 | |
Carbon evaporator | Denton Vaccum | Model 502B | |
Freeze plunger | FEI | Vitrobot Mark IV | |
Image Processing software CTFFIND3/CTFTILT | http://grigoriefflab.janelia.org/ctf | ||
Image Processing software EMAN | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2 | ||
Image Processing software Spider | http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | ||
Image Processing software Freealign | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | ||
3D visualization software Chimera | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | ||
Native Keyhole Limpet Hemocyanin | Biosyn |