Real-time Electrofysiologie: Met behulp van Closed-loop protocollen bij Probe Neuronale Dynamics and Beyond
Summary
Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.
Abstract
Experimental Neuroscience is getuige van een toenemende belangstelling voor de ontwikkeling en toepassing van nieuwe en vaak complexe, closed-loop protocollen, waarbij de stimulus toegepast, hangt in real-time de respons van het systeem. Recente toepassingen variëren van de uitvoering van virtual reality-systemen voor het bestuderen van motorische reacties, zowel in muizen 1 en 2 in de zebravis, om de controle van de aanvallen volgende corticale slag met optogenetics 3. Een belangrijk voordeel van gesloten-lus techniek ligt in het vermogen sonderen hogere dimensionale eigenschappen die niet direct toegankelijk of die afhankelijk zijn van meerdere variabelen, zoals neuronale exciteerbaarheid 4 en betrouwbaarheid, terwijl op hetzelfde moment het maximaliseren van de experimentele throughput. In deze bijdrage en in de context van cellulaire elektrofysiologie beschrijven we hoe verschillende closed-loop protocollen voor het bestuderen van de responseigenschappen van de piramidale corticale neuronen, recintracellulair orded met de patch clamp techniek in acute hersenen plakjes van de somatosensorische cortex van jonge ratten. Omdat er geen commercieel beschikbare of open source software biedt alle functies die nodig zijn voor het efficiënt uitvoeren van de hier beschreven experimenten, een nieuwe software toolbox genaamd LCG 5 werd ontwikkeld, waarvan de modulaire structuur maximaliseert hergebruik van computercode en vergemakkelijkt de implementatie van nieuwe experimentele paradigma. Stimulatie golfvormen worden opgegeven met een compacte meta-beschrijving en volledige experimentele protocollen worden beschreven in de op tekst gebaseerde configuratiebestanden. Daarnaast LCG heeft een command-line interface die geschikt is voor de herhaling van proeven en automatisering van experimentele protocollen.
Introduction
De laatste jaren heeft cellulaire electrofysiologie ontwikkeld van de traditionele open-loop paradigma gebruikt in spanning en stroom clamp experimenten moderne closed-loop protocols. De bekendste closed-loop techniek is misschien wel de dynamische klem 6,7, die de synthetische injectie van kunstmatige voltage-gated ion kanalen nodig om de neuronale membraan spanning 8 te bepalen, de grondige studie van de effecten van niet-deterministische flikkeren op ion kanalen op neuronale respons dynamiek 9, evenals de recreatie in vitro van realistische in vivo- als synaptische achtergrond activiteit 10.
Andere closed-loop paradigma's die zijn voorgesteld onder de reactieve klem 11, in vitro bestuderen van de vorming van zichzelf onderhoudende persistente activiteit en de reactie klem 4,12, de cellulaire mechanismen te onderzoeken onderliggende neuronale exciteerbaarheid.
nhoud "> Hier beschrijven we een krachtig raamwerk dat toelaat aanbrengen diverse closed-loop elektrofysiologische protocollen in de context van whole-cell patch clamp uitgevoerd acute hersencoupes. We tonen hoe somatische membraanspanning opnemen door middel van patch clamp in piramidale neuronen van de somatosensorische cortex van jonge ratten en toe te passen drie verschillende closed-loop protocollen met LCG, een command-line-gebaseerde software toolbox ontwikkeld in het laboratorium van Theoretische Neurobiologie en Neuroengineering.Kortom, de beschreven protocollen zijn, eerst de geautomatiseerde injectie van een reeks stroomtang stimulans golfvormen, die relevant zijn voor de karakterisering van een grote set van actieve en passieve membraan eigenschappen. Deze zijn voorgesteld om de elektrofysiologische fenotype van een cel vast te leggen met betrekking tot de responseigenschappen een stereotype reeks stimulus golfvormen. Bekend als de e-code van een cel (zie bijvoorbeeld & #160; 13,14) wordt een dergelijke verzameling van elektrische responsen door verscheidene laboratoria objectief neuronen classificeren op basis van hun elektrische eigenschappen. Dit omvat de analyse van de stationaire input-output overbrengend verband (FI curve), door een innovatieve techniek die de gesloten lus, real-time controle van de snelheid van afvuren gaat via een proportionele-integrale-afgeleide (PID) regelaar anderzijds de recreatie van realistische in vivo-achtige achtergrond synaptische activiteit de de vitro preparaten 10 en ten derde de kunstmatige verbinding in real-time van twee gelijktijdig opgenomen piramidale neuronen via een virtuele GABAerge interneuronen, die wordt gesimuleerd door de computer.
Bovendien, LCG implementeert de techniek die bekend staat als actieve elektrode Compensation (AEC) 15, die het mogelijk maakt de uitvoering dynamische clamp protocollen het gebruik van een enkele elektrode. Dit maakt compensatie ongewenste effecten (artifacts) van de registratie-elektrode die ontstaan bij gebruik voor het leveren van intracellulaire stimuli. De werkwijze is gebaseerd op een niet-parametrische schatting van het equivalente elektrische eigenschappen van het opnamecircuit.
De technieken en experimentele protocollen beschreven in dit document kunnen eenvoudig worden toegepast in conventionele open-loop spanning en stroom clamp experimenten en kan worden uitgebreid tot andere preparaten, zoals 4,16 extracellulaire of intracellulaire recordings in vivo 17,18. De zorgvuldige montage van de setup voor de hele cel patch clamp elektrofysiologie is een zeer belangrijke stap voor stabiele, hoge kwaliteit opnames. In het volgende gaan we ervan uit dat een dergelijke experimentele opstelling is al beschikbaar voor de experimentator, en onze aandacht richten op het gebruik van LCG beschrijven. De lezer wordt gewezen op 19-22 voor meer tips over optimalisatie en debugging.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze tekst volledig protocol voor de implementatie van real-time, gesloten-lus cel elektrofysiologische experimenten beschreven met de patch clamp techniek en een recent ontwikkelde software toolbox genoemd LCG. Om de kwaliteit van de opnames te optimaliseren is het belangrijk dat de opname setup geaard, afgeschermd en trillingsvrij: dit zorgt voor een stabiele en duurzame whole-cell toegang tot de cel, die, tezamen met de mogelijkheid van het automatiseren hele delen van de stimulatieprotocollen , maakt maximalisati…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financial support from the Flanders Research Foundation FWO (contract n. 12C9112N to DL), the 7th Framework Programme of the European Commission (Marie Curie Network “C7”, contract n. 238214; ICT Future Emerging Technology “ENLIGHTENMENT” project, contract n. 306502), the Interuniversity Attraction Poles Program initiated by the Belgian Science Policy Office (contract n. IUAP-VII/20), and the University of Antwerp is kindly acknowledged.
Materials
| Tissue slicer | Leica | VT-1000S | |
| Pipette puller | Sutter | P-97 | |
| Pipettes | WPI | 1B150F-4 | 1.5/0.84 mm OD/ID, with filament |
| Vibration isolation table | TMC | 20 Series | |
| Microscope | Leica | DMLFS | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Scientifica | PatchStar | |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | Computer controlled |
| Data acquisition card | National Instruments | PCI-6229 | Supported by Comedi Linux Drivers |
| Desktop computer | Dell | Optiplex 7010 Tower | OS: real-time Linux |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS-1002 | |
| Perfusion Pump | Gibson | MINIPULS3 | Used with R4 Pump head (F117606) |
| Temperature controller | Multichannel Systems | TC02 | PH01 Perfusion Cannula |
| Manometer | Testo | 510 | Optional |
| Incubator | Memmert | WB14 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | ACSF |
| KCl | Sigma | P9541 | ACSF, ICS |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139 | ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | ACSF |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | ACSF |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ACSF |
| Glucose | Sigma | G7528 | ACSF |
| K-Gluconate | Sigma | G4500 | ICS |
| HEPES | Sigma | H3375 | ICS |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | ICS |
| Na2-GTP | Sigma | 51120 | ICS |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ICS |
References
- Saleem, A. B., Ayaz, A., Jeffery, K. J., Harris, K. D., Carandini, M. Integration of visual motion and locomotion in mouse visual cortex. Nature neuroscience. 16, 1864-1869 (2013).
- Ahrens, M. B., Li, J. M., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).
- Paz, J. T., Davidson, T. J., et al. Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury. Nature neuroscience. 16 (1), 64-70 (2013).
- Wallach, A., Eytan, D., Gal, A., Zrenner, C., Marom, S. Neuronal response clamp. Frontiers in neuroengineering. 3 (April), 3 (2011).
- Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. Command-line cellular electrophysiology for conventional and real-time closed-loop experiments. Journal of neuroscience. 230, 5-19 (2014).
- Sharp, A., O’Neil, M., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of neurophysiology. 69 (3), 992-995 (1993).
- Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of neuroscience methods. 49 (3), 157-165 (1993).
- Vervaeke, K., Hu, H., Graham, L. J., Storm, J. F. Contrasting effects of the persistent Na+ current on neuronal excitability and spike timing. Neuron. 49 (2), 257-270 (2006).
- White, J. A., Klink, R., Alonso, A., Kay, A. R. Noise from voltage-gated ion channels may influence neuronal dynamics in the entorhinal cortex. Journal of neurophysiology. 80 (1), 262-269 (1998).
- Destexhe, a., Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neurosciences. 107 (1), 13-24 (2001).
- Fellous, J. -. M. Regulation of Persistent Activity by Background Inhibition in an In Vitro Model of a Cortical Microcircuit. Cerebral Cortex. 13 (11), 1232-1241 (2003).
- Gal, A., Eytan, D., Wallach, A., Sandler, M., Schiller, J., Marom, S. Dynamics of excitability over extended timescales in cultured cortical neurons. The Journal of neuroscience. the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (48), 16332-16342 (2010).
- Wang, Y., Toledo-Rodriguez, M., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. The Journal of physiology. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
- Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex). Cerebral cortex (New York, N.Y). 12 (4), 395-410 (1991).
- Brette, R., Piwkowska, Z., et al. High-resolution intracellular recordings using a real-time computational model of the electrode. Neuron. 59 (3), 379-391 (2008).
- Rutishauser, U., Kotowicz, A., Laurent, G. A method for closed-loop presentation of sensory stimuli conditional on the internal brain-state of awake animals. Journal of neuroscience. 215 (1), 139-155 (2013).
- Margrie, T., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 444 (4), 491-498 (2002).
- Graham, L., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and I BK in Rat and Cat Cortex. Dynamic Clamp: From Principles to Applications. , (2008).
- Sakmann, B., Neher, E. . Single-channel recording. , (1995).
- Molleman, A. . Patch Clamping. , (2002).
- Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature Protocols. 1 (3), 1235-1247 (2006).
- Gold, R. . The Axon Guide for Electrophysiolog., & Biophysics Laboratory Techniques... , (2007).
- Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Reliability of spike timing in neocortical neurons. Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).
- Buzsáki, G. Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity. Neurosciences. 105 (1), 121-130 (2001).
- Koch, C., Segev, I. . Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks. , (1988).
- Silberberg, G., Markram, H. Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells. Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).
- Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network. PLoS biology. 8 (9), (2010).
- Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. Neural networks with dynamic synapses. Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).
- Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex. Nature. 10 (6), 743-753 (2007).
