Preparação e Caracterização de SDF-1α-Quitosana As nanopartículas de sulfato de dextrano

Summary

The objective of this protocol is to incorporate SDF-1α, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1α from the nanoparticles.

Abstract

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1α-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1α is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.

Introduction

O sulfato de dextrano (DS) e quitosana (CS) são polissacarídeos com múltiplas substituídos grupos sulfato carregados negativamente (em DS), ou grupos amina carregados positivamente (desacetilados CS). Quando misturado numa solução aquosa, os dois polissacáridos formar complexos de polielectrólitos através de interacções electrostáticas. Os complexos resultantes podem formar grandes agregados que irá ser progressivamente-separado da solução aquosa (ou precipitados), pequenas partículas que são dispersíveis em água (colóides). As condições específicas que contribuem para esses resultados têm sido extensivamente estudada, e foram resumidos e ilustrado em pormenor numa publicação recente ^1. Entre essas condições, dois requisitos básicos para a produção de partículas dispersíveis em água são os polímeros de carga oposta deve 1) têm massa molar significativamente diferente; e 2) ser misturado numa relação não estequiométrica. Estas condições permitirão que os segmentos poliméricos complexados carga neutra gerados pela carganeutralização para segregar e formar o núcleo da partícula, e o excesso de polímero para formar o invólucro exterior ^1. As partículas de glicanos descritos neste protocolo são destinados para a administração pulmonar, e são projetados para serem net carregado negativamente, e de dimensões nanométricas. A carga de superfície negativa reduz a probabilidade de absorção celular das partículas de ^2,3. Partículas de dimensão nanométrica facilitar a passagem através das vias aéreas distais. Para atingir este objectivo, a quantidade de DS utilizado nesta preparação é em excesso de CS (proporção em peso de 3: 1); e alta massa molecular DS (peso-médio MW 500.000) e de baixo peso molecular, CS (MW gama 50-190 kDa, 75-85% desacetilada) são usadas.

SDF-1α é um factor homing células estaminais, que exerce a função de homing através da sua actividade quimiotáctica. SDF-1α desempenha um papel importante no retorno e manutenção de células estaminais hematopoiéticas na medula óssea e no recrutamento de ProgeNitor células no tecido periférico para a reparação de lesão ^4,5. SDF-1α tem um local de ligação à heparina na sequência da proteína, o que permite que a proteína se liga à heparina / sulfato de heparano, formam dímeros, ser protegido contra a protease (CD26 / DPPIV) inactivação, e interagem com células alvo através dos receptores de superfície celular ^6-8. DS tem propriedades estruturais semelhantes às da heparina / sulfato de heparano; assim, a ligação de SDF-1α para DS seria semelhante à dos seus ligantes poliméricos naturais.

No protocolo seguinte, descreve-se a preparação de nanopartículas de SDF-1α-DS-CS. Os procedimentos representam uma das formulações que foram previamente estudadas ^9. O protocolo é originalmente adaptado de uma investigação do VEGF-DS-CS nanopartículas ^10. Uma preparação em pequena escala é descrito, o qual pode ser facilmente dimensionado para cima com as mesmas soluções de reserva e as condições de preparação. Após a preparação, as partículas são caracterizadas by examinar seu tamanho, potencial zeta, a extensão da incorporação SDF-1α, in vitro tempo de liberação e atividade do incorporada SDF-1α.

Protocol

1. Preparação de SDF-1α Glicano Nanopartículas Devido ao efeito da administração in vivo, esterilizar todos os recipientes, pipetas, e pontas usadas na preparação. Prepare as seguintes soluções de em água ultrapura: 1% de sulfato de dextrano; NaOH 1 M (esterilizado por filtração com uma membrana PES); Quitosano a 0,1% em 0,2% de ácido acético glacial (0,8 e filtra-se através de filtros de 0,22 um, consecutivamente e ajustar o pH para 5,5 com NaOH depois); …

Representative Results

O tamanho e potencial zeta das partículas preparadas SDF-1α-DS-CS são determinadas com um analisador de partículas. A Figura 1 mostra a análise da medição do tamanho. A partir dos resultados obtidos a partir de quatro cumulantes medições repetidas, o diâmetro hidrodinâmico médio das partículas SDF-1α-DS-CS é 661 ± 8,2 (nm) e a polidispersidade é de 0,23 ± 0,02. O resultado da medição do potencial zeta é mostrado na Figura 2. A partir das cinco medições repetidas, …

Discussion

Como mencionado acima, as nanopartículas DS-CS são formados através de neutralização de cargas entre polianião (DS) e policatião (CS) moléculas. Uma vez que a interacção de cargas ocorre prontamente durante a colisão molecular, a concentração das soluções de polímero e a velocidade de agitação durante a mistura é crítica para o tamanho das partículas resultantes. A tendência geral é que DS e CS ¹⁵ soluções e maior resultado velocidade de agitação em partículas menores mais diluído…

Materials

Name	Company	Catalog number
Dextran sulfate	Fisher	BP1585-100
Chitosan, low molecular weight	Sigma	448869
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma	204986
D-Mannitol	Sigma	M9546
UltraPure water	Invitrogen	10977-023
SDF-1α	Prepared according to reference 8.
Syringe filter, PES membrane 0.22 um.	Millipore	SLGP033RS
Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm)	Fisher	14-513-63
Glass vial Kit; SUN-SRi	Fisher	14-823-182
Delsa Nano C Particle Analyzer	Backman Coulter
Eppendorf UVette Cuvets	Eppendorf	952010069
4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel	Bio-Rad	456-1096
GelCode Blue Safe Protein Stain	Fisher	PI-24592
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System	BioRad	170-8640
Corning Transwell Permeable Supports	Corning	3421
Accuri C6 Flow Cytometer	BD Biosciences
Dulbecco’s phosphate buffered saline	Sigma	D8537
Pyrogent plus kit	Fisher	NC9753738