The aim of this protocol is to expose human organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream cigarette smoke (CS) at the air-liquid interface. The impact of CS on the tissues is then investigated using a cytochrome P450 activity assay, a cilia beating measurement, and a systems biology approach.
Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease or lung cancer. To understand the underlying mechanisms of disease development, it would be important to examine the impact of CS exposure directly on lung tissues. However, this approach is difficult to implement in epidemiological studies because lung tissue sampling is complex and invasive. Alternatively, tissue culture models can facilitate the assessment of exposure impacts on the lung tissue. Submerged 2D cell cultures, such as normal human bronchial epithelial (NHBE) cell cultures, have traditionally been used for this purpose. However, they cannot be exposed directly to smoke in a similar manner to the in vivo exposure situation. Recently developed 3D tissue culture models better reflect the in vivo situation because they can be cultured at the air-liquid interface (ALI). Their basal sides are immersed in the culture medium; whereas, their apical sides are exposed to air. Moreover, organotypic tissue cultures that contain different type of cells, better represent the physiology of the tissue in vivo. In this work, the utilization of an in vitro exposure system to expose human organotypic bronchial and nasal tissue models to mainstream CS is demonstrated. Ciliary beating frequency and the activity of cytochrome P450s (CYP) 1A1/1B1 were measured to assess functional impacts of CS on the tissues. Furthermore, to examine CS-induced alterations at the molecular level, gene expression profiles were generated from the tissues following exposure. A slight increase in CYP1A1/1B1 activity was observed in CS-exposed tissues compared with air-exposed tissues. A network-and transcriptomics-based systems biology approach was sufficiently robust to demonstrate CS-induced alterations of xenobiotic metabolism that were similar to those observed in the bronchial and nasal epithelial cells obtained from smokers.
Lungs are directly and constantly exposed to inhaled air that may contain diverse toxicants such as pollutants and constituents of cigarette smoke (CS). Studying the impact of exposure to those toxicants on respiratory tissues is most informative when done in a manner that resembles in vivo exposure. Compared with the classical 2D immersed cell cultures (e.g., normal human bronchial epithelial cells (NHBE)), 3D organotypic tissue models better recapitulate the morphological, physiological, and molecular aspects of the human airway epithelium in vivo1,2: the 3D tissue models contain the diversity of the cell types observed in vivo, including differentiated epithelial cells, ciliated and non-ciliated cells, goblet cells, and basal cells. They have functional tight junctions and exhibit a mucociliary phenotype 1-3. Moreover, the cultures can be grown on a permeable porous membrane, in an air-liquid interface, allowing a direct exposure to aerosol at the apical side (whereas the basolateral side is immersed in culture medium) 3-5. Dvorak and colleagues reported that gene expression profiles of bronchial tissue models were similar to those obtained from human bronchial brushings 3. In addition, Mathis and colleagues showed that the responses of these tissue models to CS were similar to the differences observed between bronchial epithelial cells obtained from smokers and cells obtained from non-smokers 6. Finally, because the bronchial tissue models could be cultured for up to several months 4,5, they could potentially be used to examine the effects of long-term exposure of test items.
Cytotoxicity assessments are common parameters measured following chemical insults or to assess the toxicity of specific compounds or mixtures. For instance, membrane integrity can be measured by a luminescent assay and allows the measurement of a dose-dependent cytotoxic effect on the cell culture 7. However, to assess pathophysiological effects of compounds at subtoxic concentrations, other parameters should be measured. For example, tissue integrity determined using the transepithelial electrical resistance (TEER) assay ensures the functionality of tight junctions and monitors the disruption of the epithelial layer 8,9. Ciliary beating frequency also allows the measurement of CS-related effects on respiratory tissues. A normal beating frequency for the cilia lining bordering the upper and lower respiratory tract is important to protect against airway infections 10. Each of the ciliated columnar epithelial cells of the respiratory epithelium has 200-300 cilia beating at a particular frequency to eliminate infectious agents or inhaled particulate matter trapped in the mucus released by interspersed goblet cells 11. CS contains chemicals that may inhibit ciliary beating 12, leading to a reduced protection of the respiratory tract. This work shows that ciliary beating can be measured in organotypic tissue models. This approach allows assessment of whether epithelial cells exhibit their normal function in the organotypic tissue culture. CS also activates xenobiotic metabolism responses in the respiratory tract to metabolize tobacco smoke constituents 13. The activity of the phase I xenobiotic metabolism enzymes, CYP1A1 and CYP1B1, of the tissue models can be measured. Additionally, as previously reported, global gene expression can be measured in the organotypic bronchial tissue models 6,14,15. A transcriptomic data and network-based systems biology approach is leveraged to assess the impact of CS on xenobiotic metabolism 15.
The methodologies used to expose organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream CS using an in vitro exposure system and to measure the tissue responses to this exposure compared to fresh air exposure (control) are detailed here.
Aquí, hemos demostrado la aplicabilidad de los modelos de tejidos nasales bronquial y organotípico humano para evaluar el impacto de la exposición repetida CS. Como alternativa a la experimentación con animales, se han desarrollado una serie de sistemas de exposición para las evaluaciones toxicológicas de la exposición al aerosol in vitro (por ejemplo., Vitrocell, Cultex, ALICE, etc.). Estos módulos de exposición también se pueden utilizar para una evaluación toxicológica de los contaminantes del aire, partículas en el aire, nanopartículas, etc. En este estudio, hemos utilizado el sistema Vitrocell que puede acomodar hasta 48 muestras diferentes de forma simultánea, lo que permite más grandes experimentos a escala y una menor variabilidad entre tratamientos. Para cada exposición al aerosol in vitro, el riesgo de contaminación de cultivo de tejidos sigue siendo un riesgo importante cuya mitigación exige un manejo cuidadoso de los cultivos de tejidos a lo largo de los experimentos.
Medición de la deposición de partículas en tiempo real en la microbalanza durante el eexperimento Xposure permite monitorear que las dosis CS generados por el sistema de exposición son conformes a las expectativas. Para asegurar la exactitud de la deposición de partículas medido, creación de la medición en línea correctamente antes de la exposición es critial, por ejemplo, el establecimiento de la escala a 0. Además, debido a la diferencia entre las áreas de la microbalanza (2 cm) y la inserción de cultivo de tejido (0,33 cm 2), se ajustó el cálculo final de la zona de la inserción de cultivo: sólo el 33% de la deposición sobre la microbalanza refleja la deposición real en el inserto de cultivo.
La medición de la TEER para determinar la funcionalidad de barrera apretado nudo y para evaluar la interrupción de la capa epitelial es un procedimiento relativamente fácil de implementar, que se informó aquí. Sin embargo, debido a que los modelos de tejidos bronquiales y nasales contienen células caliciformes intercalados productoras de moco, lavado apical debe realizarse antes de las meas TEERmedi-. El lavado apical es crítico debido a la presencia de la capa de moco y la variabilidad de su espesor puede sesgo de la medición de la TEER, interferring con el impacto de la exposición CS. Esta noción está de acuerdo con lo reportado por Hilgendorf y sus colegas, en el que la permeabilidad de las células Caco-2 se vio afectada por el co-cultivo con la línea de células caliciformes productoras de moco HT29 23. El moco necesita ser lavada antes de la medición TEER, porque el lavado apical justo antes de la exposición puede interferir con las respuestas de los tejidos a CS. Por lo tanto, la medición se lleva a cabo tres días antes de la exposición, y no justo antes de la exposición.
Hemos demostrado que la actividad de CYP1A1 / CYP1B1 podría medirse a partir de los modelos de cultivos organotípicos tras la exposición CS aunque la actividad se incrementó sólo modestamente por CS. Esta señal débil puede ser amplificada por una incubación más largo del sustrato CYP1A1 / 1B1 (es decir., Luciferina-CEE), por ejemplo para24 h (datos no mostrados). Una de las limitaciones de la medición de la actividad de CYP en el presente trabajo es la ausencia de normalización a nivel de la proteína CYP o para el recuento de células, lo que podría ser tomada en consideración para futuros estudios para garantizar que la alteración en la actividad de la enzima no se ve influenciada por la alteración de ya sea el nivel de proteína o el recuento de células.
Nos informó que la exposición CS inhibe la ciliar superando tanto en los modelos de tejido bronquial y nasal. Observaciones similares se realizaron en diversos modelos de mamíferos y no mamíferos 12. Para ciliar batiendo medición, asegurando que los tejidos son manipulados y tratados de manera similar es crítica, por ejemplo, si se implementa el cambio medio, debe ser aplicado en todas las muestras. Sutto y sus colegas informaron que el pH afecta la ciliar mamíferos latiendo frecuencia 24. Por lo tanto, al comparar superando frecuencias entre las células tratadas con diferentes COMPUESTOS / mezclas, pHajuste debe ser considerado para minimizar la variabilidad de la medición latido ciliar. Además, la temperatura a la que se lleva a cabo la medición es también crítico como la frecuencia de golpeo ciliar disminuye con la disminución de la temperatura. Para minimizar la variabilidad debida a estos cambios, una incubadora de etapa superior, equipadas con la temperatura, CO2 y de la humedad se utilizó en este estudio. A pesar de ello, se observó que el ciliar batiendo frecuencias en los tejidos bronquiales después de la exposición CS eran muy variables (es decir., Aumentar en un inserto y disminuir en el otro inserto), lo que sugiere que el movimiento ciliar es correcto altamente perturbado después de la exposición. En contraste, se observó la ausencia de frecuencias de batido ciliar medibles en el tejido nasal después de la exposición CS, lo que sugiere que la respuesta del tejido nasal es más sensible y consistente. Esto está de acuerdo con una publicación anterior que demuestra que el tejido de la nariz tiene una menor capacidad para desintoxicar comoen comparación con el bronquio 25.
Por último, hemos demostrado que la expresión de genes de perfiles del bronquial organotípico y modelos de tejidos nasales expuestos a CS podría demostrar un impacto de CS en el metabolismo de xenobióticos. Curiosamente, la alteración observada en el metabolismo de xenobióticos en el organotípicos bronquial y nasal en modelos in vitro expuestos a CS asemejan a la de la situación in vivo en los fumadores como se discute en mayor detalle en una publicación anterior 15. Para los análisis de la expresión génica, usando el instrumento robótico hace un análisis de alto rendimiento posible. Por otra parte, el manejo robótico automático aumenta aún más la consistencia y exactitud de los resultados de la expresión génica. Sin embargo, la recogida rápida de las muestras de tejido era crítico para evitar la degradación del ARN durante la extracción de RNA. El procesamiento del ARN y los enfoques transcriptomic descritos aquí también se pueden aplicar a in vivo muestras de tejido.
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer a Maurice Smith y Marja Talikka para su revisión del manuscrito.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MucilAir-human fibroblasts-bronchia | Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland | http://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/ | |
MucilAir Culture Medium | Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland | http://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/ | |
VITROCELL | VITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Germany | http://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R= | |
3R4F reference cigarette | University of Kentucky | http://www2.ca.uky.edu/refcig/ | |
30-port carousel smoking machine SM2000 | Philip Morris, Int. | ||
CiliaMetrix camera and software | La Haute École de Gestion (HESGE), Geneva, Switzlerland | ||
Leica DMIL microscope | Leica, Heerbrugg, Switzerland | ||
LED light source | Titan Tool Supplies, Buffalo, NY | ||
Chopstick Electrode STX-2 | World Precision Instruments | http://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/ | |
EVOMXTM Epithelial Voltohmmeter | World Precision Instruments | http://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/ | |
Luciferin Detection Reagent | |||
MagNA Lyser Instrument | Roche | http://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66 | |
chloroform | Sigma-Aldrich | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion= | |
QIAcube | Qiagen | 9001882 | |
NanoDrop | Thermo Scientific | http://www.nanodrop.com/ | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106 | |
Affymetrix GeneChip High throughput 3’IVT Express Kit | Affymetrix | http://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit | |
Scanner 3000 7G | Affymetrix | http://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G |