Murino Aislado Modelo Corazón de aturdimiento miocárdico asociado a paro cardioplégico

Summary

The goal of this protocol to assess myocardial stunning following ischemic cardioplegic arrest in rodents.

Abstract

El siguiente protocolo es de utilidad para evaluar la función cardiaca deteriorada o elevando insultos isquémicos moderados miocardio. La técnica es útil para el modelado de la lesión isquémica asociada con numerosas fenómeno clínicamente relevante, incluyendo cirugía cardíaca con parada cardiopléjica y bypass cardiopulmonar, la cirugía sin CEC, trasplante, angina, isquemia breve, etc. El protocolo presenta un método general para modelar hipotermia arresto cardioplégica hipercaliémica y reperfusión en los corazones de roedores que se centran en la medición de la función contráctil del miocardio. En resumen, un corazón de ratón se perfunde en el modo de Langendorff, equipado con un globo intraventricular, y se registran los parámetros funcionales cardíacos iniciales. Tras la estabilización, el corazón se somete a breves infusión de una solución de cardioplejía hipotermia cardioprotector para iniciar arresto diastólica. Cardioplegia se entrega de forma intermitente durante 2 horas. El corazón está entonces reperfundido y Warmed para las temperaturas y la recuperación de la función miocárdica normotérmicos se supervisa. El uso de este protocolo los resultados en función contráctil cardiaca deprimida confiable libres de daño en el tejido miocárdico bruto en roedores.

Introduction

Aturdimiento miocárdico se define como reversible reducción de la actividad contráctil a pesar de la restauración del flujo sanguíneo adecuado después de un breve período de isquemia o períodos prolongados de insultos isquémicos con ^1,2,3,4,5 cardioprotección. El método presentado se utiliza específicamente para modelar insultos isquémicos clínicamente relevantes que pueden resultar en alteraciones reversibles en la función contráctil (es decir, los insultos isquémicos asociados con la cirugía cardíaca utilizando parada cardiopléjica, breves períodos de isquemia, angina de pecho, etc.). En contraste con los estudios de isquemia grave (infarto de miocardio, necrosis) fue desarrollado este protocolo para evaluar la recuperación funcional del miocardio y la cardioprotección sin lesión de los tejidos, remodelación, y la muerte celular. La mayoría del trabajo se analiza un protocolo de parada cardiopléjica estándar con elementos similares a una cirugía cardíaca utilizando la hipotermia y la entrega cardioplejía intermitente.

Prot miocardioreflexión durante la mayoría de las cirugías cardíacas se basa en cardioplegia y bypass cardiopulmonar. Aunque cardioplejía soluciones y estrategias (CP) varían ampliamente (sangre, cristaloide, frío, caliente etc.) los elementos más comunes son 1) la hiperpotasemia y / u otras estrategias para detener el corazón en diástole, limitando así la utilización de energía resultante de la contracción miocárdica, y 2) la hipotermia para ralentizar el metabolismo y ayudar a mantener la ATP y otras reservas de energía mientras arrestado. Soluciones de cardioplejía actuales proporcionan protección al corazón contra los insultos isquémicos que de otro modo resultarían letales. Sin embargo, las estrategias cardioprotectoras durante insultos isquémicos quirúrgicos no son perfectos, y la lesión isquémica leve resultante puede dar lugar a una disfunción contráctil cardiaca reversible pesar de un flujo sanguíneo adecuado (aturdimiento miocárdico), acidosis, daños cardiomiocitos, y los efectos vasculares incluyendo la perfusión coronaria reducida y el vasoespasmo.

Este protocolo se diferenciaa partir de modelos de isquemia del corazón aislado estándar evaluación de infarto de miocardio e isquemia severa en que se evalúa insultos isquémicos más suaves que puede resultar en la función cardiaca deteriorada siguiente breve isquemia o insultos isquémicos asociados con la parada cardiopléjica. (Para una revisión de técnicas de perfusión Langendorff y I / R en ver ^6-8). Para obtener directrices generales y un análisis exhaustivo de los parámetros experimentales asociadas con aislados de ratones corazones perfundidos ver Sutherland e t al. 2003 ⁹ La técnica que aquí se presenta detalla el equipamiento necesario, reactivos, pasos, estrategias y consejos para inducir de manera fiable impresionante en los corazones de ratón. Pequeñas modificaciones son necesarias para aplicar la técnica a ratas.

Brevemente corazones aislados de ratones se Langendorff perfundidos durante aproximadamente 30 minutos con tampón fisiológico Krebs-Henseleit (KHB), seguidos por el frío paro cardiaco protegida a través de la entrega de una hipotermia hipercaliémicasolución de cardioplejía ic. Tras la detención, la recuperación funcional cardíaca se controla durante el recalentamiento y la reperfusión del corazón con KHB. Los cambios en el grado de recuperación de la función contráctil cardiaca pueden ser evaluados para evaluar agentes cardioprotectores y diferentes estrategias de cardioprotección.

Protocol

NOTA: Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional Animal Vida útil Cuidado y Uso y todos los animales y los procedimientos de acuerdo con la Guía Nacional Research Council para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio 10. 1. Fabricación Globo y Presión ventricular izquierda Monitoreo del Circuito Construya globos LV según Miller et al. 11 En un vaso de precipitados con una barra de agitación, mezcla 9,5 ml de agua …

Representative Results

La Figura 1 presenta los resultados típicos de un experimento del ratón. LVP (línea roja), dP / dt (línea verde), y la temperatura (línea morada) se registraron continusouly sobre ~ 3 horas. Las letras indican a – medida de referencia, b, c, d, e – la entrega de la solución de cardioplejía, f – inicio de la reperfusión, g, h, i, j – medición de flujo cornary durante la reperfusión. Nota, LVDP deprimido y dP / dt en la reperfusión en comparación con la línea base. Figura 1B …

Discussion

Los métodos de detalles de protocolo precedentes para evaluar el aturdimiento miocárdico secundaria a isquemia global asociado con parada cardiopléjica. En nuestras manos este protocolo produce una reducción aproximada del ~ 40% de la función cardíaca (LVDP, +/- dP / dt) con cambios mínimos en la frecuencia cardíaca en el punto de tiempo posterior a la reperfusión 30 min. A medida que el corazón está reperfunde y recalentado todos los parámetros de la función cardíaca se reducen en los puntos iniciales de …

Materials

Cardioplegia Solution (St Thomas II)			Symbol / Concentrations (mM)
Sodium Chloride			NaCl; 110
Potassium chloride			KCl; 16
Calcium Chloride			CaCL2; 1.5
Magnesium Chloride			MgCL2; 16
Sodium Bicarbonate			NaHCO3; 10
Krebs-Heinslet Buffer
Sodium Chloride			NaCl; 118
Potassium Chloride			KCl; 4.8
Magnesium Sulfate			MgSO4; 1.7
Sodium Bicarbonate			NaHCO3; 24.9
Potassium Phosphate (monobasic)			KH2PO4; 1.2
Calcium Chloride			CaCL2; 1.4
Sodium Pyruvate			Na pyruvate; 2
Glucose			C6H12O6; 6
Balloon reagents
Corn Syrup
Spaghetti
Silicon Dispersion Gel
styrofoam block
lab oven/incubator ( 50C)
Langendorff Perfusion equipment
Isolated perfused heart sytem (IH-SR (Hugo-Sachs) or equivalent)
Data acquisition system (DSI, ADinstruments or equivalent)
Heated water circulator
Cooling water circulator
Perfusion pump capable of 2-30 ml/min
Inline perfusion filters – 1 um glass fiber
Pressure sensors and amplifiers for LVP and perfusion pressure
Small graduated cylinder (~10 mL)
Small temperature probe and thermometer (Werner or equivalent)
perfusion resevoir (1L)
cardioplegia resevoir (~200 mL)
gas bubbler
95/5 O2/CO2 mix
Surgical tools and reagents
Metzenbaum and Potz surgical scissors
two Dumont size 5 forceps
ketamine
xylazine
heparin
small clamp with soft sides to hold aorta (i.e. terminal clamp with taped ends)
Silk 2-0 and 4-0 sutures