新生儿缺氧缺血性脑病的小猪模型

Summary

Hypoxic-ischemic encephalopathy following perinatal asphyxia can be studied using animal models. We demonstrate the procedures necessary for establishing a piglet model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy.

Abstract

出生窒息，从而导致缺氧缺血性脑病（HIE），占全球的66万例死亡，每年，大约有四分之一的世界290万新生儿死亡。缺氧缺血性脑病的动物模型有助于在HIE的病理生理的理解，并强调，在发生脑损伤的动态过程，由于围产期窒息。因此，动物的研究表明一个时间窗后的损伤的治疗策略。低温已经过测试作为pdiglet模型HIE处理，并随后在临床试验中证明是有效的。该模型的变化在辅助神经保护方法和氙气和褪黑激素的仔猪研究的研究已应用于导致临床I期和II期试验^1,2。仔猪HIE模型还用于新生儿resuscitation-和血流动力学研究，以及脑缺氧细胞水平上的调查。然而，这是一个在技术上具有挑战性模型和变化的协议，可能会导致要么太轻微或太严重的脑损伤。在这篇文章中，我们表现出必要建立新生儿缺氧缺血性脑病稳定仔猪模型的技术方法。首先，新生仔猪（<24小时的时候，平均重量1500克）麻醉，插管，并在设置相媲美，在新生儿重症监护病房发现监控。全球缺氧缺血通过降低吸入氧分数达到全球缺氧，低血压，通过缺血和一台跟踪振幅整合脑电图（aEEG的）指示脑缺氧所致。生存是通过根据所述aEEG的响应和血压调节充氧促进。脑损伤通过组织病理学和磁共振成像72小时后定量。

Introduction

围产期窒息与缺氧缺血性脑病（HIE）相关的急性和不可预测的频繁条件。该协议的总体目标是展示围产期缺氧缺血性脑病的仔猪存活率模型。该模型可用于研究对体液如血液，脑脊液和尿液的实验处理对神经病理学，磁共振成像和光谱学（MRI和MRS）和生物标志物的新生儿脑和不同程度缺氧缺血的效果。该模型也证明用于研究心血管系统，呼吸系统，肾和肝，所有这些都受到影响全球缺氧缺血有用。

围产期窒息是妥协供氧产或立即产后期的结果。产缺氧事件，占全球的66万死亡人数每年，大约有四分之一的世界2.9磨离子新生儿死亡，2012年^3。2010年115万婴儿估计已经开发新生儿脑病出生后窒息^4。 HIE定义为脑病妊娠34周后出生的婴儿发生在1-3 / 1000个活产⁵在工业化世界和高达8.5 / 1000名活产婴儿在发展中国家^4。死亡的风险为10-60％，和神经障碍中的幸存者^{30-100％6,7-}风险。 5020万伤残调整生命年（DALYs）是由于分娩缺氧事件^4。目前唯一的治疗比为支持其他HIE是后缺氧低温。因此，在诊断过程和治疗策略的进步所必需的改进的HIE ⁸的管理。

在围产期窒息及新生儿脑损伤后管理预后改进基于扩大潜在疾病机制的知识ð可能的治疗方法。缺氧缺血性脑病的动物模型中是特别有用的为不同的临床事件可能导致HIE和发病率中的任何单个分娩中心是低^5。测试新的预后和诊断工具和治疗策略时的实验装置，其中生物变化的影响可被最小化，是必不可少的。动物模型应接近临床情况尽可能接近，从而有利于诱导损伤和参与该疾病和it's结果⁹的动态过程背后的病理机制的理解。新生儿缺氧缺血性脑病的动物模型中已经包括了若干种，包括啮齿动物，羊和猪。相比较而言，新生仔猪具有较高的相似性人类新生儿相对于大小，心血管系统¹⁰和脑的成熟在交货^11,12的时间。监控，仪器仪表和成果评价中的仔猪模型类似于THAT在临床护理婴儿缺氧缺血性脑病的使用。因此，存在一个高度翻译成新生儿护理从这个模型。

围产期缺氧，缺氧缺血性脑病仔猪模型所使用的许多团体和不同的许多领域^13。根据实验的目的，必须小心注意支付给药物的选择，诱导缺血缺氧，控制侮辱持续时间和严重程度，后期侮辱复苏和护理，成果评价方法的方法。为了避免偏见的随机试验的设计应始终在干预研究中使用。

当诱导缺氧缺血性损伤所采用的方法是很重要的。全球缺氧导致的HIE经常导致多器官衰竭涉及脑，心脏，肺，肾和肝。根据评估结果，缺氧缺血性脑病模型应该基于全球缺氧缺血，而不是依赖于脑缺血， 例如 ，开车结扎otid动脉^14。最近的一篇论文缺氧应用颈动脉受压的组合_（2氧合指数12％），并同时维持平均动脉压“40毫米汞柱^2。另一组引起的全球缺氧8％的O _2，直到负碱过量> 20毫摩尔/升或平均动脉血压（MABP）<15毫米汞柱，并处死动物在4小时^15。缺氧也被滴定通过心输出量（基线的30％-40％），MABP（30-35毫米汞柱）和动脉pH值^{（6.95-7.05）16。}

全球缺氧缺血aEEG的抑制一个类似于本报告中提出滴定，车型已经证明了脑病是临床，电生理，神经病理学和媲美的窒息足月儿^17,18中发现的情况。

缺氧缺血性脑病引起的程度是至关重要的。 HIE的有用的动物模型还必须考虑新的测试直径诺斯替过程和治疗方案。为了实现这一目标，该车型应该引起中度HIE，其中有一个潜在的治疗为重型颅脑损伤，很少或没有处理潜在的评估新的治疗方法的时候会少有关。对缺氧的耐受试验动物之间的差别很大。以前的研究已经表明，更一致的脑损伤，可以实现，并且更多的动物存活^17,19通过使用在整个一组氧合指数₂的值根据每个仔猪由振幅整合脑电图（aEEG的）来评价脑响应个体化的诱导缺氧而不是缺氧事件。 aEEG的抑制的持续时间关联到脑损伤的程度，以在几个组织病理学改变<20分钟aEEG的抑制和严重癫痫发作是增加> 45分钟aEEG的抑制。对HIE神经保护治疗最近的审查中发现的需要生存模式，使行为结果MEAS数目字的动物模型^20。

还有的提出HIE仔猪模型的许多优点。它是基于一个物种，其中结果是高度可能转化为人体生理学。全球缺氧缺血模型多器官衰竭和缺血缺氧的滴定通过aEEG的诱导一致的程度脑损伤与存活的临床相关的结果，使得生物标志物，MRI和行为可以在相关的时间点进行评价。

围生期窒息和缺氧缺血性脑病仔猪模型不仅当前洞察HIE病理生理显著贡献，而且还成功之前的临床试验，最终导致人类的新疗法。仔猪模型研究起到在建立低温作为HIE ²¹处理了关键作用，并且在新生儿复苏研究²²被使用。执行中窒息和缺氧缺血性脑病，是时候研究不同群体已经使用仔猪模型ð研究包括低温^23，α-黑素细胞激素^24，心跳骤停^25，酪氨酸羟化酶活性^26，反复低氧暴露^27，NMDA受体活性^14，和近红外光谱^28。

仔猪HIE模型本报告中提出的在技术上具有挑战性的工作，作为程序的过程中微小的调整，可能会导致要么太轻微或太严重颅脑损伤^29.2。我们发现，现有文献缺乏足够的细节重现此前公布​​的模型。因此，我们在这里展示所必需的这份报告在建立仔猪72小时的生存模式的技术程序的每一步，使研究人员能够建立这种先进的型号为缺氧缺血性脑病的研究。

Protocol

本方案经丹麦动物实验督察。所有试验动物麻醉整个程序。此协议的复制必须进行按照国家伦理和动物福利的指导方针，并经当地伦理委员会。 1.动物丹麦长白仔猪<24小时岁，体重约1500 – 2000克 2.麻醉和维护液体备所需的麻醉的设备（ 图1）：对于七氟醚给药，酒精棉签，外周静脉导管，橡皮筋，注射器用盐水，丙泊酚…

Representative Results

缺血缺氧对大脑的损伤引起的过程中发生的影响记录在案记录aEEG的痕迹。代表性aEEG的跟踪示于图6。 图6.代表aEEG的痕迹。低幅度因缺血缺氧。 请点击此处查看该图的放大版本。 p…

Discussion

由于它的复杂性，所描述的模型仅可在设施认证实施​​并经历了动物实验。批准当地伦理委员会之前必须对实验的起始获得，并且最佳动物福利必须保证在任何时候。由于模型是基于试验动物的存活，但重要的是无菌的环境是在侵入性过程，以防止感染维持。

麻醉的选择是很重要的，因为大多数如果不是所有的麻醉药物具有潜在神经保护性质。在先前公布的模型之间的差?…

Materials

Warm-touch-pediatric blanket	Covidien	5030840
Adhesive Apertrue Drape	Barrier	915447
Utility Drape (sterile) 75×80 cm	Barrier	800530
Neoflon	BD – Luer	391350
Laryngoscope	Miller	85-0045
Endotracheal tube 2.5 mm	Covidien	111-25
Endotracheal tube 3.0 mm with cuff	Unomedical	MM61110030
Endotracheal tube 3.5 mm with cuff	Unomedical	MM61110035
Anesthesia machine	GE Healthcare	1009-9002-000
EEG – electrodes/disposable subdermal needle electrode	Cephalon	ACCE120550
ECG – electrodes	medtronic	3010107-003
ECG-electrodes for MR	philips	ACCE120550
Arterial blood sampler – aspirator	Radiometer medical ApS	956552
Polyurethane Umbilical vein catheter (5 Fr/Ch)	Covidien	8888160341
Polyurethane Umbilical vein catheter (3,5 Fr/ch)	Covidien	8888160333
Suture set (size 3-0)	Covidien	8886 623341
BD Spinal needle 0.7x38mm	BD needles	405254
Gas with 96% Nitrogen / 4% oxygen	Air Liquide	made on order
NeuroMonitor (CFM) system	Natus Medical Incorporated	OBM70002