Myh6-Promotörle Seçim ile kombinasyonu ES-Hücre-Programlama dayanarak Kemirgen Kardiyak Kalp Pili Hücre Agregaların Üretimi
Summary
Bu protokol, kemirgen pluripotent kök hücreler (PSC) fonksiyonel sinüs düğüm doku üretmek açıklamaktadır. T-Box3 (TBX3) ekspresyonu artı kalp Myosin ağır zincir (Myh6) promotör antibiyotik seçimi son derece saf kalp pili hücre agrega yol açar. Bu "İsteyerek-sinoatrial-organları" ("iSABs"), son derece dayak oranları arttı göstermek% 80'in üzerinde kalp pili hücreleri içeren ve miyokard ex vivo pace edebiliyoruz.
Abstract
"Hasta sinüs sendromu" Tedavi yapay kalp pili dayanmaktadır. Bunlar pil arızası ve enfeksiyonlar gibi tehlikeleri ayı. Ayrıca, hormon eksikliği yanıt ve genel prosedür maliyeti yoğundur. PSC'ler oluşturulan "Biyolojik kalp pilleri" bir alternatif haline gelebilir, ancak Embriyoid Oluşumu kalp pili hücrelerinin tipik içeriği (EBS) son derece düşüktür. açıklanan protokol Myh6-organizatörü bazlı antibiyotik seçimi ile sinüs düğümü indükleyici TBX3 yoluyla kemirgen PSC'lerin "ileri programlama" birleştirir. Bu>% 80 fizyolojik fonksiyonel kalp pili hücrelerinin tutarlı kardiyomiyosit agrega verir. Bu "uyarılmış-sinoatrial-organları" ("iSABs") kendiliğinden fare kalplerinden izole düğüm hücrelere karşılık gelen henüz ulaşılmamış frekanslarda (400-500 bpm) olarak sözleşme ve kemirgen miyokard ex vivo pace edebiliyoruz. Açıklanan protokol oldukça saf sinüs kullanmaNodal tek hücreler in vitro ilaç testi için kullanılabilir, ki burada, örneğin oluşturulabilir. Ayrıca, bu protokole göre üretilen iSABs kalp doku mühendisliği yolunda çok önemli bir adım olabilir.
Introduction
dönem "hasta sinüs sendromu" kalp pili sisteminin bozulmasına yol açan birden hastalıkları özetler. Bu patolojik, semptomatik sinüs bradikardi, sinoatrial blok, sinüs tutuklama yanı sıra taşikardi-bradikardi sendromu oluşur. Böylece, bir "hasta sinüs sendromu", genellikle böyle bir iskemik kalp hastalığı, kardiyomiyopati ya da miyokardit gibi genel kalp hastalıkları eşlik ediyor. Şu anda, tedavi yaklaşımları elektrik pili implantasyonu dayanmaktadır. Ancak, bu tür enfeksiyonların ve pil arızası gibi risklerin bir dizi ile birlikte gider. Genel olarak, komplikasyonların insidansı halen hastaların yapay kalp pili implante olan çok yüksektir. Endojen kalp karşı Ayrıca, bu cihazlar, hormon stimülasyonuna yanıt vermez.
Gelecekteki bir alternatif olan PSC'ler hizmet verebilir "biyolojik kalp pili" durumu güveniyor olabilirUygun bir hücre kaynağı olan ve aynı zamanda in vitro ilaç testi için oldukça yararlı olacaktır. Ancak, büyük bir sorun embriyoid organları (EBS) içindeki sinüs düğüm hücrelerin çok nadir görünüm yatıyor – bu genellikle ~% 0.5 1 aşmaz.
Daha önce, bu özel kardiyomiyosit alt tiplerine karşı "ileri programlama", yani ilgili Mesoderm-özgü arka 1 (MesP1) ve NK2 transkripsiyon faktörü, lokus 5 (Nkx2.5) 2 gibi farklı erken kardiyovasküler transkripsiyon faktörlerinin aşırı ifadesi yoluyla mümkün olduğu gösterilmiştir, 3. Normal boyut ve sinoatriyal düğüm (SAN) bir fonksiyonu için, T-box transkripsiyon faktörü Tbx3 pili gen programının başlatılmasını ve SAN 4 farklılaşmasını kontrol ettiği gösterilmiştir olan, son derece önemlidir. Bu fonksiyonel kalp pili hücrelerinin görünümünü gelişmiş iken, içeriği hala tüm cardiomyocytic hücre popülasyonu içinde ~ 40% geçmedi.
Bu nedenle, ek bir Myh6-organizatörü bazlı antibiyotik seçimi adım 5 bizim tarafından tanıtıldı. In vitro ekili bir kemirgen kalbin olanlar ve karşılaştırılabilir yaklaşıldığıdır ilk kez in vitro yüksek artış yenerek frekansları (> 400 bpm) sergilerler; Bu sonuçta henüz farkedilmemiş kardiyomiyosit agrega (iSABs "" uyarılmış Çin-atriyal organları ") yol açar bir murin kalp 6 izole sinüs düğüm hücreleri. İzoprenalin yönetimi altında 550 bpm bile dayak frekansları elde edilir. Özellikle, iSABs 7 analizleri geniş fizyolojik itibaren belirgin% 80'in üzerinde fonksiyonel düğüm hücreleri oluşur. Son zamanlarda, çeşitli yaklaşımlar doğrudan yeniden programlama 19 kullanılarak Sinus düğüm hücreleri oluşturmak için, yüzey 16,17 tarif edildi küçük moleküller ile 14 ya da farmakolojik tedavi işaretler. Ancak, bu yöntemlerin hiçbiri kalp pili hücrelerinin böyle bir yüksek saflıkta yol açtı ve murin yakın frekansları yenerek osanat iSABs görüldüğü gibi.
Dahası, spontan dayak aktivitesini kaybetmiş ekili yetişkin fare ventriküler dilimleri bir ex vivo modelde, iSABs, dilim dokusu içine entegre böylece kendiliğinden aktif kalan ve sağlam kasılmaların 7 kalp dilimleri pacing yeteneğine sahiptir. Bu iSABs üretimi için ayrıntılı bir protokol bu yazıda açıklanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
yetenek "biyolojik kalp pili" anlamında uygun kalp ritminin sulandırma izin verebilir hücre kaynaklı kalp pili kök hücreler üretmek için. Aynı şekilde, in vitro uyuşturucu testi onların durumu yararlanacaktır. PSC'leri kalp pili hücresi özellikleri 8,9,10,11,12,13 ile kardiyomiyositlere dahil memeli vücudunun herhangi bir hücre türüne yol açabilir. Ancak, genellikle "Embriyoid Bodies" içinde hücre popülasyonları kaçınılmaz güvenilir bir seçim ve izolasyon s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number |
| Iscove's liquid medium with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0465 |
| DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0435 |
| CLS type IV, CLS IV | Biochrom AG | C4-22 |
| Non-essential amino acids | Biochrom AG | K 0293 |
| FBS Superior | Biochrom AG | S 0615 |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Biochrom AG | L 0473 |
| G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile | Biochrom AG | A 2912 |
| Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile | Brand | 703409 |
| Accutase | eBioscience,Inc. | 00-4555-56 |
| Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette | Eppendorf | 4861000155 |
| Falcon Cell Strainer 40µm | Falcon | 352340 |
| Penicillin/Streptomycin | GE Healthcare | P11-010 |
| Petri Dishes | Greiner BioOne | 663102 |
| DPBS without Ca and Mg | PAN-Biotech | P04-36500 |
| Fetal bovine serum | PAN-Biotech | P30-3302 |
| Leukemia inhibitory factor | Phoenix Europe GmbH | LIF-250 |
| Quadratic petri dishes | Roth | PX67.1 |
| Gelatin from cold water fish skin | SigmaAldrich | G7765 |
| 2-Mercaptoethanol | SigmaAldrich | M3148 |
| 1-Thioglycerol | SigmaAldrich | M6145 |
| Tissue culture dishes | TPP | 93100 |
| Tissue culture flask | TPP | 90076 |
| Tissue culture test plates (24 well) | TPP | 92424 |
References
- Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48 (3), 173-182 (1991).
- David, R., et al. MesP1 drives vertebrate cardiovascular differentiation through Dkk-1-mediated blockade of Wnt-signalling. Nat Cell Biol. 10, 338-345 (2008).
- David, R., et al. Forward programming of pluripotent stem cells towards distinct cardiovascular cell types. Cardiovasc Res. 84 (2), 263-272 (2009).
- Hoogaars, W. M., et al. Tbx3 controls the sinoatrial node gene program and imposes pacemaker function on the atria. Genes Dev. 21 (9), 1098-1112 (2007).
- Klug, M. G., Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., Field, L. J. Genetically selected cardiomyocytes from differentiating embronic stem cells form stable intracardiac grafts. J Clin Invest. 98 (1), 216-224 (1996).
- Marger, L., et al. Pacemaker activity and ionic currents in mouse atrioventricular node cells. Channels (Austin). 5 (3), 241-250 (2011).
- Jung, J. J., et al. Programming and isolation of highly pure physiologically and pharmacologically functional sinus-nodal bodies from pluripotent stem cells). Stem cell reports. 2 (5), 592-605 (2014).
- Maltsev, V. A., Wobus, A. M., Rohwedel, J., Bader, M., Hescheler, J. Cardiomyocytes differentiated in vitro from embryonic stem cells developmentally express cardiac-specific genes and ionic currents. Circulation research. 75 (2), 233-244 (1994).
- He, J. Q., Ma, Y., Lee, Y., Thomson, J. A., Kamp, T. J. Human embryonic stem cells develop into multiple types of cardiac myocytes: action potential characterization. Circ Res. 93 (1), 32-39 (2003).
- Yanagi, K., et al. Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels and T-type calcium channels confer automaticity of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem cells. 25 (11), 2712-2719 (2007).
- Barbuti, A., et al. Molecular composition and functional properties of f-channels in murine embryonic stem cell-derived pacemaker cells. J Mol Cell Cardiol. 46 (3), 343-351 (2009).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American journal of physiology. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H2006-H2017 (2011).
- David, R., Franz, W. M. From pluripotency to distinct cardiomyocyte subtypes. Physiology (Bethesda). 27 (3), 119-129 (2012).
- Scavone, A., et al. Embryonic stem cell-derived CD166+ precursors develop into fully functional sinoatrial-like cells). Circ Res. 113 (4), 389-398 (2013).
- Morikawa, K., et al. Identification, isolation and characterization of HCN4-positive pacemaking cells derived from murine embryonic stem cells during cardiac differentiation. Pacing Clin Electrophysiol. 33 (33), 290-303 (2010).
- Wiese, C., et al. Formation of the sinus node head and differentiation of sinus node myocardium are independently regulated by Tbx18 and Tbx3. Circ Res. 104 (3), 388-397 (2009).
- Kleger, A., et al. Modulation of calcium-activated potassium channels induces cardiogenesis of pluripotent stem cells and enrichment of pacemaker-like cells. Circulation. 122 (18), 1823-1836 (2010).
- Bakker, M. L., et al. T-box transcription factor TBX3 reprogrammes mature cardiac myocytes into pacemaker-like cells. Cardiovasc Res. 94 (3), 439-449 (2012).
- Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18. Nat Biotechnol. 31 (1), 54-62 (2013).
- Johns, D. C., et al. Adenovirus-mediated expression of a voltage-gated potassium channel in vitro (rat cardiac myocytes) and in vivo (rat liver). A novel strategy for modifying excitability. J Clin Invest. 96 (2), 1152-1158 (1995).
- Nuss, H. B., Marban, E., Johns, D. C. Overexpression of a human potassium channel suppresses cardiac hyperexcitability in rabbit ventricular myocytes. J Clin Invest. 103 (6), 889-896 (1999).
