Purificazione delle proteine tecnica che permette la rilevazione di sumoilazione e Ubiquitinazione di lievito in erba cinetocore proteine Ndc10 e Ndc80
Summary
Questo manoscritto descrive la rilevazione di sumoilazione e ubiquitinazione delle proteine cinetocore, Ndc10 e Ndc80, nel lievito Saccharomyces cerevisiae erba.
Abstract
Modificazioni post-traduzionali (PTM), come fosforilazione, metilazione, acetilazione, ubiquitinazione e sumoilazione, regolano la funzione cellulare di molte proteine. PTM di proteine cinetocore che associano con il DNA centromerico mediano fedele segregazione dei cromosomi per mantenere la stabilità del genoma. Approcci biochimici come la spettrometria di massa e analisi di western blot sono più comunemente utilizzati per l'identificazione di PTM. Qui, un metodo di purificazione della proteina è descritto che permette il rilevamento di entrambe sumoylation e ubiquitinazione delle proteine cinetocore, Ndc10 e Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. Un ceppo che esprime polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) e Myc-tagged Ndc10 o Ndc80 è stato costruito e utilizzato per i nostri studi. Per il rilevamento di sumoylation, abbiamo ideato un protocollo per affinità purificare proteine sumoylated His-tagged utilizzando perline di nichel e usato western blot con anticorpi anti-Myc per rilevare sumoylated Ndc10 unnd Ndc80. Per il rilevamento di ubiquitinazione, abbiamo ideato un protocollo per immunoprecipitazione di proteine Myc-tag e utilizzato analisi Western Blot con anticorpi anti-Ub per dimostrare che Ndc10 e Ndc80 sono ubiquitinate. I nostri risultati mostrano che epitopi di proteine tag di interesse per il suo-Flag tagged ceppo Smt3 facilita l'individuazione di molteplici PTM. Studi futuri dovrebbero consentire lo sfruttamento di questa tecnica per identificare e caratterizzare le interazioni proteina che dipendono da uno specifico PTM.
Introduction
Ubiquitinazione e sumoilazione permettono la coniugazione di ubiquitina e Modifier Piccolo ubiquitina-simile (SUMO, Smt3 in S. cerevisiae 1) ad una proteina bersaglio, rispettivamente. PTM di proteine cinetocore influenzano i livelli cellulari e interazioni proteina-proteina durante le diverse fasi del ciclo cellulare per garantire fedele segregazione dei cromosomi. Ad esempio, i livelli cellulari di Cse4 / CENP-A e proteine cinetocore esterno DSN1 sono regolate da proteolisi ubiquitina-mediata per garantire la stabilità del genoma 2-5. Destabilizzazione degli allegati cinetocore-microtubuli non corretti richiede la B chinasi Ipl1 / Aurora, che fosforila Dam1 e Ndc80 complessi che interagiscono direttamente con i microtubuli 6-8. Nonostante l'identificazione di oltre settanta proteine cinetocore, ci sono molto pochi gli studi che indagano le modifiche di queste proteine con PTM, ad esempio, l'ubiquitina e SUMO. Una limitazione importante è la capacità di conservare la PTMs durante la purificazione e la scarsità di anticorpi personalizzati per la rilevazione di PTM come sumoylation, fosforilazione, metilazione, e altri. Caratterizzazione di proteine cinetocore sumoylated Ndc10, Cep3, Bir1, e Ndc80 utilizzato un anticorpo personalizzato 9. Inoltre, Ndc10 è stata implicata come substrato per 10 ubiquitinazione. Hec1 umana (Ndc80 in S. cerevisiae) è anche substrato per ubiquitinazione, regolato da APC / C-hCdh1 E3 ligasi 11. Pertanto, Ndc10 e Ndc80 sono buoni candidati per l'ottimizzazione del protocollo per rilevare sia sumoilazione e ubiquitinazione in S. cerevisiae.
Per facilitare l'individuazione di sumoilazione, abbiamo costruito i ceppi che esprimono HF-Smt3 e Myc-tag Ndc10 o Ndc80. L'uso di tag epitopi (HF: His6-Flag) riduce al minimo il fondo a causa della cross-reattività che è frequente nel siero policlonale sollevata contro una proteina candidato. Abbiamo ideato un protocollo per affinitàpurificare coniugati HF-Smt3 e poi utilizzati commerciale anti-Flag e anticorpi anti-myc per rilevare la presenza di sumolyated Ndc10 e Ndc80 nella preparazione Smt3 purificato. Per ubiquitination, abbiamo ideato un protocollo immunoprecipitazione modificata che conserva ubiquitinazione delle proteine cinetocore Myc-targhette e svolta western blot con l'anticorpo commerciale anti-Ub per rilevare ubiquitinazione di Ndc10 e Ndc80.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tag epitopo quali HA, Myc, Bandiera, e GST sono ampiamente utilizzati per l'analisi biochimica delle proteine. Costruzione di ceppi con HF-Smt3 e proteine cinetocore Myc-tag, come Ndc10 e Ndc80, facilita l'individuazione di PTM, come sumoilazione e ubiquitinazione. HF-Smt3 tirare giù test permette la rilevazione di proteine cinetocore sumoylated, Ndc10 e Ndc80 (Figura 1). Il protocollo di purificazione per affinità e western blot utilizzando un anticorpo anti-Flag stabilire la spec…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Oliver Kerscher for support and advice and members of the Basrai laboratory for their support and comments on the paper. This work was supported by the National Institutes of Health Intramural Research Program.
Materials
| Glass beads | BioSpec Products | 11079105 | 0.5 mm dia. |
| Mini beadbeater | BioSpec Products | #693 | 8 cell disrupter |
| Ni-NTA superflow | Qiagen | 30430 | 100 ml |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8215 | 1 ml |
| Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | A7470 | 1 ml |
| Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | F1804 | Primary antibody, dilution 1:1000 |
| c-Myc antibody (A-14) | Santa Cruz Biotechnology | sc-789 | Primary antibody, dilution 1:5000 |
| Purified mouse antibody monoclonal 9E10 | Covance | MMS-150P | Primary antibody, dilution 1:5000 |
| Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody | Covance | MMS-258R | Primary antibody, dilution 1:1000 |
| ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab | GE Healthcare Life Sciences | NA934V | Secondary antibody, dilution 1:5000 |
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab | GE Healthcare Life Sciences | NA931V | Secondary antibody, dilution 1:5000 |
| DC protein assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Nitrocellulose membrane | Novex | LC2001 | 0.45 mm pore size |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Novex | NP0321BOX | 1.0 mm, 10 well |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Novex | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Transfer Buffer | Novex | NP0006-1 | 20x |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34078 | |
| 10x PBS pH7.4 | GIBCO | 70011-044 | |
| Blue sensitive X-Ray film | Dbio | DBOF30003 | |
| Automatic developer | Kodak | M35AX-OMAT | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | 50 mg |
| MG-132 | Selleck Chemicals | S2619 | 25 mg |
References
- Johnson, P. R., Hochstrasser, M. SUMO-1: Ubiquitin gains weight. Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).
- Hewawasam, G., et al. Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4. Mol Cell. 40, 444-454 (2010).
- Ranjitkar, P., et al. An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain. Mol Cell. 40, 455-464 (2010).
- Au, W. C., et al. A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis. Génétique. 194, 513-518 (2013).
- Akiyoshi, B., et al. The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein. PLoS Genet. 9, e1003216 (2013).
- Biggins, S., et al. The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast. Genes Dev. 13, 532-544 (1999).
- Cheeseman, I. M., et al. Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p. Cell. 111, 163-172 (2002).
- Liu, D., Lampson, M. A. Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase. Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).
- Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation. J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).
- Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).
- Li, L., et al. Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability. Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).
- Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II. Génétique. 172, 783-794 (2006).
- Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells. Biotechniques. 42, 158 (2007).
- Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).
- Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Kinetochore assembly: if you build it, they will come. Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).
