Isolering af primære humane Colon tumorceller fra Kirurgiske Væv og Dyrkning dem direkte på Soft Elastic Substrater for Traction Cytometry
Summary
A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.
Abstract
Kræftceller svare matrix mekanisk stivhed på en kompleks måde under anvendelse af en koordineret, hierarkisk mekanisk-kemisk system bestående af adhæsionsreceptorer og tilhørende signaltransduktion membranproteiner, den cytoskeletale arkitektur og molekylære motorer 1, 2. Mechanosensitivity forskellige cancerceller in vitro er undersøgt primært med immortaliserede cellelinier eller murine afledte primære celler, ikke med primære humane cancerceller. Derfor er lidt kendt om mechanosensitivity af primære humane coloncancer-celler in vitro. Her er en optimeret protokol udviklet som beskriver isolering af primære humane colon celler fra raske og kræft kirurgiske humane vævsprøver. Isoleret colonceller derefter med held dyrket på blødt (2 kPa stivhed) og stiv (10 kPa stivhed) polyacrylamid-hydrogeler og stiv polystyren (~ 3,6 GPa stivhed) substrater funktionaliseret af en ekstracellulær matrix (fibronectinI dette tilfælde). Fluorescerende mikroperler er indlejret i bløde geler nær cellekulturen overflade, og trækkraft assay udføres for at vurdere cellulære kontraktile spændinger ved hjælp af gratis open access software. Desuden immunfluorescensmikroskopi på forskellige stivhed substrater giver nyttige informationer om primær celle morfologi, cytoskelet organisation og vinculin indeholdende fokale adhæsioner som funktion af substrat stivhed.
Introduction
I de senere år er det blevet mere klart, at mekanisk mikromiljø, udover bio-kemiske faktorer, spiller en vigtig rolle i reguleringen af celle- funktioner. Celler kan sanse og reagere på substratet stivhed, hvorpå de er klæbet til (som i 2D kultur) eller omgivet af (som i 3D kultur) 3-7. Ved at gøre dette kan celler modulere deres differentiering 3, morfologi 4, migration / motilitet 5, biofysiske egenskaber 6, vækst 7, og andre processer.
Kræftceller også reagere på 2D- og 3D-matrix stivhed ved hjælp af en koordineret, hierarkisk mekanisk-kemisk kombination af adhæsionsreceptorer og tilhørende signaltransduktion membranproteiner, den cytoskeletal arkitektur og molekylære motorer 1, 2. For eksempel brystepitelceller celler (MEC'er) danne normale acinære parenkym når de dyrkes på 150 Pa substrater, der svarer til stivhedenaf sunde brystvæv. Interessant, de udviser kendetegnende for et udviklingsland tumor, både strukturelle og transkriptionelle, når dyrket på stivere substrater (> 5.000 Pa), der efterligner stivheden af en tumor stroma 8. Endvidere viser et andet eksperiment, bryst tumorigenese er ledsaget af collagentværbinding og ECM afstivning 9. Nylige eksperimenter viser, at human colon carcinoma (HCT-8) celler vise metastase lignende fænotype (MLP), når de dyrkes på 2D substrater med fysiologisk relevant stivhed (20-47 kPa), men ikke på meget stiv (3,6 GPA) substrater 10- 12 .Disse celler første form tumor-lignende celle klynger og derefter tage afstand fra hinanden, startende fra periferien. Da dette epitel til afrundede morfologiske (E til R overgang) sker ændringer, de formere sig, reducere celle-celle og celle-ECM vedhæftning og blive vandrende. HCT-8 celler dyrket på meget hårde polystyren substrater ikke udviser dissemaligne træk. Således er det blevet antaget, at HCT-8 celler bliver metastatiske grund af deres eksponering for passende mikromiljø. Det er værd at bemærke, at disse forsøg udføres med immortaliserede cancercellelinier eller murine afledte primære celler, ikke med primære humane cancerceller.
En nylig undersøgelse foreslår, at augmented cellulære trækkraft stress kan anvendes som en potentiel biofysisk signatur for metastatiske celler 13 .Den undersøgelse omfatter måling trækkraft for forskellige humane cancercellelinier på polyacrylamidgeler. Det konstateres, at metastatiske cancerceller kan udøve væsentlig højere trækkraft stress sammenlignet med ikke-metastatiske celler i alle tilfælde 13. Men disse resultater direkte modstrid med de tidligere offentliggjorte resultater om murine afledt brystkræft cellelinier 14. Også, fremhæver en nylig undersøgelse bemærkelsesværdige forskelle mellem immortaliserede og primære humane celler i deres cytoskeletal remodeling protein profilering og celleoverlevelse proteinekspression 15. Derfor er det vigtigt at revidere mange af de biofysiske målinger, herunder trækkraft til primære humane cancerceller. Dette vil behandle spørgsmålet om, hvorvidt de primære celler rekapitulere immortaliseret cancer cellelinjer trækkraft tendens.
Protokollen beskrevet her er optimeret til isolering af primære humane colon-celler (både raske og kræft), og til dyrkning af dem på bløde substrater (polyacrylamid hydrogeler) samt på Petriskåle. Protokollen er baseret på fordøjelse og deraf følgende enzymatisk dissociation af kirurgisk vævsprøve i enkelt cellesuspension 16. Så vidt vi ved, er dette den første påvisning af dyrkning isoleret primær colon tumor og normale celler direkte på bløde hydrogel substrater med indlejret fluorescerende mikroperler til trækkraft cytometri. Gennemsigtige gel substrater tillader også immunfarvning. Denne analyse afslørede forskelle i F-actin organisation ogfokale sammenvoksninger i primære humane kolon celler som substrat stivhed ændringer. Denne cellekultur platform giver mulighed for at udforske forskellige biofysiske egenskaber af primære humane celler såsom celle stivhed og trækkraft som parametre for kræft prognosticering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cellular trækkraft stress har for nylig vist sig som en potentiel biofysisk indikator for metastatisk tilstand 13. Dog findes der ingen eksperimentelle trækkraft data med primære tumorceller i litteraturen til dato. Desuden er direkte dyrkning isolerede primære kolon celler på forskellige stivhed polyacrylamidgeler ikke rapporteret endnu. Derfor etablerer vi en optimeret primær kolon celledyrkningsbetingelser på geler og polystyren (figur 2). Fluorescerende mikroperler indkapsling nær…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was funded by the National Science Foundation ECCS grant 10-02165, and the Interdisciplinary Innovation Initiative Program, University of Illinois grant 12035. M.Y. A. was funded at UIUC from NIH National Cancer Institute Alliance for Nanotechnology in Cancer ‘Midwest Cancer Nanotechnology Training Center’ Grant R25 CA154015A. Immnunostaining and confocal microscopy imaging were carried out at the Institute for Genomic Biology (IGB), UIUC. M.Y.A. acknowledges the discussions with B. J. Williams of UIUC regarding the isolation experiments. M.Y.A. acknowledges C. Nemeh and Abdul Bhuiya of UIUC for assistance in schematic and materials list preparation.
Materials
| Reagents | |||
| HBSS | Life technologies | 14175-095 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Trypsin | Worthington | LS003736 | |
| Collagenese | Worthington | LS004176 | |
| 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 01201-5 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| N- methylenebisacrylamide (bis) | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Nˊ-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Human fibronectin | BD biosciences | 354008 | |
| Hydrazine hydrate | Sigma-Aldrich | 18412 | Hazardous |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT15710 | |
| Signal enhancer | Life technologies | I36933 | |
| Monoclonal anti vinculin antibody | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A11001 | |
| TRITC phalloidin conjugates | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 0.1 µm fluroscent beads | Life technologies | F8801 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25200-056 | |
| Materials | |||
| 12 mm2 glass cover slips | Corning | 2865-12 |
References
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer Metastasis Rev. 28, 113-127 (2009).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil. Cytoskeleton. 60, 24-34 (2005).
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (25), 3661-3665 (1997).
- Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophys. J. 93, 4453-4461 (2007).
- Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 279, 1345-1350 (2000).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophys. J. 99, 2460-2469 (2010).
- Ali, M. Y., Saif, M. T. A. Substrate Stiffness Mediated Metastasis Like Phenotype of Colon Cancer Cells is Independent of Cell to Gel Adhesion. Cell. Mol. Bioeng. , (2014).
- Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. A. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. , (2014).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Indra, I., Undyala, V., Kandow, C., Thirumurthi, U., Dembo, M., Beningo, K. A. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys. Biol. 8 (1), (2011).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. J. Proteome Res. 5 (4), 862-878 (2006).
- Oikonomou, E., Kothonidis, K., Zografos, G., Nasioulas, G., Andera, L., Pintzas, A. Newly established tumourigenic primary human colon cancer cell lines are sensitive to TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo. Br. J. Cancer. 97 (1), 73-84 (2007).
- Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J. Vis. Exp. (91), (2014).
- Wang, Y. L., Pelham, R. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
- Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8, 3197-3206 (2012).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10-16 (2010).
- Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).
- Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS ONE. 5 (9), e12905 (2010).
- Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
- Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).
