Aislamiento de células tumorales de colon humanos primarios de tejidos quirúrgicos y cultivándolas Directamente en Elastic sustratos blandos de tracción Citometría
Summary
A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.
Abstract
Las células cancerosas responden a matriz de rigidez mecánica de una manera compleja usando un sistema coordinado, jerárquica mecano-químico compuesto de receptores de adhesión y proteínas de la membrana de transducción de señales asociadas, la arquitectura citoesquelética, y motores moleculares 1, 2. Mecanosensibilidad de las diferentes células cancerosas in vitro son investigado principalmente con las líneas celulares inmortalizadas o células primarias de murino derivado, no con células cancerosas humanas primarias. Por lo tanto, se sabe poco acerca de la mecanosensibilidad de células de cáncer de colon humanas primarias in vitro. Aquí, un protocolo optimizado se desarrolla que describe el aislamiento de las células del colon humanos primarios a partir de muestras de tejidos humanos quirúrgicos sanos y cancerosos. Las células del colon aislados son entonces cultivadas con éxito en sustratos funcionalizados por una matriz extracelular blando (2 kPa rigidez) y rígido (10 kPa rigidez) hidrogeles de poliacrilamida y poliestireno rígido (~ 3,6 GPa rigidez) (fibronectinaen este caso). Microperlas fluorescentes están incrustados en geles suaves cerca de la superficie de cultivo de células, y el ensayo de tracción se lleva a cabo para evaluar las tensiones contráctiles celulares utilizando software de acceso libre y gratuito. Además, la microscopía de inmunofluorescencia en diferentes sustratos de rigidez proporciona información útil sobre la morfología celular primaria, la organización del citoesqueleto y vinculina que contiene adhesiones focales como una función de la rigidez del sustrato.
Introduction
En los últimos años se ha convertido en cada vez más evidente que mecánica micro-entorno, además de los factores bio-químicas, juega un papel importante en la regulación de las funciones celulares. Las células pueden detectar y responder a la rigidez sustrato sobre el que se adhieren a (como en la cultura 2D) o rodeados por (como en cultivo 3D) 3-7. Al hacerlo, las células pueden modular su diferenciación 3, 4 morfología, migración / motilidad 5, las propiedades biofísicas 6, 7 crecimiento, y otros procesos.
Las células cancerosas también responden a la rigidez de la matriz 2D y 3D utilizando una coordinada, combinación jerárquica mecano-químico de los receptores de adhesión y proteínas de la membrana de transducción de señales asociadas, la arquitectura citoesquelética, y motores moleculares 1, 2. Por ejemplo, las células epiteliales mamarias (MECs) formar parénquima normal acinar cuando se cultiva en sustratos 150 Pa que es similar a la rigidezde tejido mamario sano. Curiosamente, exhiben las características de un tumor en desarrollo, tanto estructurales como la transcripción, cuando se cultivan en sustratos rígidos (> 5000 Pa) que imitan la rigidez de un estroma tumoral 8. Además, otro experimento muestra que la tumorigénesis de mama se acompaña de reticulación de colágeno y ECM de refuerzo 9. Experimentos recientes muestran que (HCT-8) células de carcinoma de colon humano muestran metástasis como fenotipo (MLP) cuando se cultivan en sustratos 2D tienen rigidez fisiológicamente relevante (20-47 kPa), pero no en muy rígido (3.6 GPa) sustratos 10- 12 .Estos células primero forman grupos de células tumorales y luego se disocian el uno del otro, a partir de la periferia. Como este epitelial a redondeadas morfológica (E a R transición) se produce el cambio, proliferan, reducir célula-célula y célula-ECM adherencia, y convertirse migratoria. HCT-8 células cultivadas sobre sustratos de poliestireno muy duras, que no presentan estosrasgos malignos. Así, se ha planteado la hipótesis de que HCT-8 células se vuelven metastásico debido a su exposición a las micro-entorno adecuado. Vale la pena señalar que estos experimentos se llevan a cabo con las líneas celulares de cáncer inmortalizadas o células primarias de murino derivado, no con células cancerosas humanas primarias.
Un estudio reciente propone que la tensión de tracción celular aumentada se puede utilizar como un potencial biofísico firma para las células metastásicas 13 .El estudio implica la medición de la fuerza de tracción para diferentes líneas celulares de cáncer humano en geles de poliacrilamida. Se encuentra que las células cancerosas metastásicas pueden ejercer significativamente mayor esfuerzo de tracción en comparación con las células no metastásicas en todos los casos 13. Sin embargo, estos resultados contradicen directamente los resultados publicados anteriormente en murino líneas celulares derivadas de cáncer de mama 14. Además, un estudio reciente pone de manifiesto diferencias notables entre las células humanas inmortalizadas y primaria en su pro remodelación del citoesqueletoperfiles de proteína y la supervivencia celular expresión de la proteína 15. Por lo tanto, es importante volver a visitar muchos de los ensayos biofísicos incluyendo tracción para las células cancerosas humanas primarias. Esto se abordará la cuestión de si las células primarias recapitulan inmortalizada líneas celulares de cáncer tendencia tracción.
El protocolo descrito aquí está optimizado para el aislamiento de células primarias humanas de colon (tanto sanas y cancerosas), y para el cultivo de ellos en sustratos blandos (hidrogeles de poliacrilamida), así como en placas de Petri. El protocolo se basa en la digestión y la consiguiente disociación enzimática de muestra de tejido quirúrgico en suspensión de células individuales 16. Para nuestro conocimiento, esta es la primera demostración de cultivo aislado tumor de colon primario y las células normales directamente sobre sustratos de hidrogel blandas con microperlas fluorescentes embebidos para citometría de tracción. Sustratos gel transparente también permiten inmunotinción. Este ensayo reveló diferencias en la organización F-actina yadherencias focales en las células del colon humanas primarias como cambios de rigidez del sustrato. Esta plataforma de cultivo celular se abre la posibilidad de explorar diversas propiedades biofísicas de células humanas primarias tales como rigidez celular y la tracción como parámetros para pronósticos de cáncer.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tensión de tracción celular ha surgido recientemente como un potencial indicador biofísico del estado metastásico 13. Sin embargo, no existen datos tracción experimental con células tumorales primarias en la literatura hasta la fecha. Además, el cultivo de las células del colon directamente aislados primaria en diferentes geles de poliacrilamida rigidez no se informa todavía. Por lo tanto, establecemos un colon primaria optimizadas las condiciones de cultivo de células en geles y poliestireno <st…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was funded by the National Science Foundation ECCS grant 10-02165, and the Interdisciplinary Innovation Initiative Program, University of Illinois grant 12035. M.Y. A. was funded at UIUC from NIH National Cancer Institute Alliance for Nanotechnology in Cancer ‘Midwest Cancer Nanotechnology Training Center’ Grant R25 CA154015A. Immnunostaining and confocal microscopy imaging were carried out at the Institute for Genomic Biology (IGB), UIUC. M.Y.A. acknowledges the discussions with B. J. Williams of UIUC regarding the isolation experiments. M.Y.A. acknowledges C. Nemeh and Abdul Bhuiya of UIUC for assistance in schematic and materials list preparation.
Materials
| Reagents | |||
| HBSS | Life technologies | 14175-095 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Trypsin | Worthington | LS003736 | |
| Collagenese | Worthington | LS004176 | |
| 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 01201-5 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| N- methylenebisacrylamide (bis) | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Nˊ-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Human fibronectin | BD biosciences | 354008 | |
| Hydrazine hydrate | Sigma-Aldrich | 18412 | Hazardous |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT15710 | |
| Signal enhancer | Life technologies | I36933 | |
| Monoclonal anti vinculin antibody | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A11001 | |
| TRITC phalloidin conjugates | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 0.1 µm fluroscent beads | Life technologies | F8801 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25200-056 | |
| Materials | |||
| 12 mm2 glass cover slips | Corning | 2865-12 |
References
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer Metastasis Rev. 28, 113-127 (2009).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil. Cytoskeleton. 60, 24-34 (2005).
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (25), 3661-3665 (1997).
- Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophys. J. 93, 4453-4461 (2007).
- Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 279, 1345-1350 (2000).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophys. J. 99, 2460-2469 (2010).
- Ali, M. Y., Saif, M. T. A. Substrate Stiffness Mediated Metastasis Like Phenotype of Colon Cancer Cells is Independent of Cell to Gel Adhesion. Cell. Mol. Bioeng. , (2014).
- Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. A. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. , (2014).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Indra, I., Undyala, V., Kandow, C., Thirumurthi, U., Dembo, M., Beningo, K. A. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys. Biol. 8 (1), (2011).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. J. Proteome Res. 5 (4), 862-878 (2006).
- Oikonomou, E., Kothonidis, K., Zografos, G., Nasioulas, G., Andera, L., Pintzas, A. Newly established tumourigenic primary human colon cancer cell lines are sensitive to TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo. Br. J. Cancer. 97 (1), 73-84 (2007).
- Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J. Vis. Exp. (91), (2014).
- Wang, Y. L., Pelham, R. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
- Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8, 3197-3206 (2012).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10-16 (2010).
- Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).
- Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS ONE. 5 (9), e12905 (2010).
- Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
- Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).
