Isolering av primära humana kolontumörceller från kirurgiska vävnader och Odling dem direkt på mjuka elastiska substrat för Traction Cytometry
Summary
A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.
Abstract
Cancerceller svarar på matris mekanisk styvhet på ett komplext sätt med användning av en samordnad, hierarkisk mekano-kemiskt system som består av adhesionsreceptorer och associerade signaltransduktion membranproteiner, cytoskelettala arkitektur och molekylmotorer 1, 2. Mechanosensitivity av olika cancerceller in vitro är undersökas i första hand med odödliggjorda cellinjer eller murina härledd galvaniska element, inte med primära humana cancerceller. Därför lite är känt om mechanosensitivity av primära humana koloncancerceller in vitro. Här är ett optimerat protokoll som utvecklats som beskriver isolering av primära humana kolonceller från friska och cancer kirurgiska mänskliga vävnadsprover. Isolerade kolon celler är sedan framgångsrikt odlas på mjuka (2 kPa styvhet) och stel (10 kPa styvhet) polyakrylamid hydrogeler och styv polystyren (~ 3,6 GPa styvhet) substrat funktionaliserade med en extracellulär matris (fibronektinI det här fallet). Fluorescerande mikropärlor är inbäddade i mjuka geler nära cellodlingsytan, och dragkraft analysen utförs för att bedöma cellulära sammandragande påkänningar som använder fri öppen tillgång programvara. Dessutom immunofluorescensmikroskopi på olika styvhet substrat ger värdefull information om primär cell morfologi, cytoskelett organisation och vinkulin innehåller fokala kontakter som en funktion av substrat styvhet.
Introduction
På senare år har det blivit allt tydligare att mekanisk mikromiljö, förutom bio-kemiska faktorer, spelar en viktig roll vid reglering cell funktionaliteter. Celler kan känna och svara på substratet styvhet som de följs (som i 2D kultur) eller omges av (som i 3D kultur) 3-7. Genom att göra så, kan celler modulera deras differentiering 3, morfologi 4, migration / rörlighet 5, bio-fysiska egenskaper 6, tillväxt 7, och andra processer.
Cancerceller reagerar också till 2D och 3D matrix styvhet med hjälp av en samordnad, hierarkisk mekano-kemisk kombination av vidhäftningsreceptorer och tillhörande signaltransduktion membranproteiner, cytoskelettala arkitektur och molekylära motorer 1, 2. Till exempel bröst epitelceller (MEC) bilda normala acinar parenkymet Vid odling på 150 Pa-substrat som liknar styvhetenfriska bröstvävnad. Intressant, de uppvisar kännetecknen för ett utvecklings tumör, både strukturella och transkription, när odlade på styvare substrat (> 5000 Pa) som efterliknar styvheten hos ett tumörstroma 8. Dessutom visar ett annat experiment att brösttumörgenes åtföljs av kollagentvärbindning och ECM förstyvande 9. Nya experiment visar att human koloncancer (HCT-8) celler visar metastaser som fenotyp (MLP) när de odlas på 2D-substrat med fysiologiskt relevant styvhet (20-47 kPa), men inte på mycket hård (3,6 GPa) substrat 10- 12 .Dessa cellerna först bildar tumörliknande cellkluster och dissocierar sedan från varandra, utgående från periferin. Eftersom denna epitelial till rundade morfologiska (E R övergång) förändring sker, de förökar sig, minska cell-cell och cell-ECM vidhäftning och bli vandrande. HCT-8-celler odlas på mycket hårda polystyren substrat inte uppvisar dessamaligna egenskaper. Sålunda har en hypotes om att HCT-8 celler blir metastatisk på grund av deras exponering för lämplig mikromiljö. Det är värt att notera att dessa experiment utförs med odödliga cancercellinjer eller murina härledd galvaniska element, inte med primära humana cancerceller.
En nyligen genomförd studie föreslår att förstärkt cellulär dragkraft stress kan användas som en potentiell biofysikalisk signatur för metastaserande celler 13 .Det studie innebär att mäta dragkraft för olika humana cancercellinjer på polyakrylamidgeler. Man har funnit att metastatiska cancerceller kan utöva signifikant högre dragkraft spänning jämfört med icke-metastatiska celler i samtliga fall 13. Men dessa resultat direkt motsäger tidigare avgöranden som offentliggörs på murina härledd bröstcancercellinjer 14. Även en ny studie belyser anmärkningsvärda skillnader mellan immortaliserade och primära humana celler i deras cytoskeletal ombyggnad protein profilering och cellöverlevnad proteinuttryck 15. Därför är det viktigt att se över många av de biofysikaliska tester inkluderande dragkraft för primära humana cancerceller. Detta kommer att ta upp frågan om de primära cellerna rekapitulera immortaliserad cancercellinjer dragkraft trend.
Protokollet som beskrivs här är optimerad för isolering av primära humana kolonceller (både friska och cancer), och för att odla dem på mjuka substrat (polyakrylamid hydrogeler) samt på petriskålar. Protokollet är baserat på matsmältningen och därav enzymatisk dissociation av kirurgiska vävnadsprov in i enkelcellsuspension 16. Såvitt vi vet är detta den första demonstrationen att odla isolerade primära kolontumör och normala celler direkt på mjuka hydrogel substrat med inbäddade fluorescerande mikrokulor för dragkraft Cytometry. Transparent gel substrat också tillåta immunfärgning. Denna analys visade skillnader i F-aktin organisation ochfokala sammanväxningar i primära humana kolonceller som substrat stelhet förändringar. Denna cellodlings plattform öppnar upp möjligheten att utforska olika biofysiska egenskaper hos primära humana celler såsom cell styvhet och dragkraft som parametrar för cancer prognostik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cellular dragkraft stress har nyligen dykt upp som en potentiell biofysikalisk indikator av metastaserad staten 13. Det finns dock inga experimentella dragkraft data med primärtumörceller i litteraturen hittills. Dessutom är direkt odling isolerade primära kolon celler på olika styvhet polyakrylamidgeler inte rapporterats ännu. Därför etablerar vi en optimerad primära kolon cellodlingsbetingelser på geler och polystyren (Figur 2). Fluorescerande mikropärlor inkapsling nära cellodl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was funded by the National Science Foundation ECCS grant 10-02165, and the Interdisciplinary Innovation Initiative Program, University of Illinois grant 12035. M.Y. A. was funded at UIUC from NIH National Cancer Institute Alliance for Nanotechnology in Cancer ‘Midwest Cancer Nanotechnology Training Center’ Grant R25 CA154015A. Immnunostaining and confocal microscopy imaging were carried out at the Institute for Genomic Biology (IGB), UIUC. M.Y.A. acknowledges the discussions with B. J. Williams of UIUC regarding the isolation experiments. M.Y.A. acknowledges C. Nemeh and Abdul Bhuiya of UIUC for assistance in schematic and materials list preparation.
Materials
| Reagents | |||
| HBSS | Life technologies | 14175-095 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Trypsin | Worthington | LS003736 | |
| Collagenese | Worthington | LS004176 | |
| 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 01201-5 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| N- methylenebisacrylamide (bis) | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Nˊ-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Human fibronectin | BD biosciences | 354008 | |
| Hydrazine hydrate | Sigma-Aldrich | 18412 | Hazardous |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT15710 | |
| Signal enhancer | Life technologies | I36933 | |
| Monoclonal anti vinculin antibody | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A11001 | |
| TRITC phalloidin conjugates | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 0.1 µm fluroscent beads | Life technologies | F8801 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25200-056 | |
| Materials | |||
| 12 mm2 glass cover slips | Corning | 2865-12 |
References
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer Metastasis Rev. 28, 113-127 (2009).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil. Cytoskeleton. 60, 24-34 (2005).
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (25), 3661-3665 (1997).
- Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophys. J. 93, 4453-4461 (2007).
- Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 279, 1345-1350 (2000).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophys. J. 99, 2460-2469 (2010).
- Ali, M. Y., Saif, M. T. A. Substrate Stiffness Mediated Metastasis Like Phenotype of Colon Cancer Cells is Independent of Cell to Gel Adhesion. Cell. Mol. Bioeng. , (2014).
- Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. A. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. , (2014).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Indra, I., Undyala, V., Kandow, C., Thirumurthi, U., Dembo, M., Beningo, K. A. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys. Biol. 8 (1), (2011).
- Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. J. Proteome Res. 5 (4), 862-878 (2006).
- Oikonomou, E., Kothonidis, K., Zografos, G., Nasioulas, G., Andera, L., Pintzas, A. Newly established tumourigenic primary human colon cancer cell lines are sensitive to TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo. Br. J. Cancer. 97 (1), 73-84 (2007).
- Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J. Vis. Exp. (91), (2014).
- Wang, Y. L., Pelham, R. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
- Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8, 3197-3206 (2012).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10-16 (2010).
- Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).
- Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS ONE. 5 (9), e12905 (2010).
- Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
- Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).
