Isolation des droits de cellules primaires de tumeurs du côlon à partir de tissus chirurgicaux et les cultivant directement sur élastique souple substrats pour Traction cytométrie

M. Yakut Ali; Sandeep V. Anand; Krishnarao Tangella; Davendra Ramkumar; Taher A. Saif

doi:10.3791/52532

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Article de méthode

Isolation des droits de cellules primaires de tumeurs du côlon à partir de tissus chirurgicaux et les cultivant directement sur élastique souple substrats pour Traction cytométrie

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DOI :

10.3791/52532

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4 juin 2015

M. Yakut Ali¹ , Sandeep V. Anand¹ , Krishnarao Tangella²^,³ , Davendra Ramkumar²^,³ , Taher A. Saif¹^,⁴

¹Department of Mechanical Science and Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, ²College of Medicine, University of Illinois at Urbana-Champaign, ³Provena Covenant Medical Centre, ⁴Micro and Nanotechnology Laboratory, University of Illinois at Urbana-Champaign

Dans cet article

Résumé

Un protocole est décrit pour extraire des cellules humaines primaires de la tumeur du côlon chirurgical et des tissus normaux. Les cellules isolées sont ensuite cultivées sur des substrats élastiques souples (hydrogels de polyacrylamide) fonctionnalisés par une protéine de matrice extracellulaire, et noyées dans des microbilles fluorescentes. La cytométrie de traction est réalisée pour évaluer les stress contractiles cellulaires.

Résumé

Les cellules cancéreuses réagissent à la matrice de rigidité mécanique d'une manière complexe en utilisant un hiérarchique système coordonné mécano-chimique composée de récepteurs d'adhésion et les protéines de membrane de transduction de signal associées, l'architecture du cytosquelette et moteurs moléculaires ^{1, 2.} mécanosensibilité de cellules cancéreuses différentes in vitro sont étudiée principalement avec des lignées cellulaires immortalisées ou des cellules primaires de souris, dérivé avec des cellules non cancéreuses humaines primaires. Par conséquent, on en sait peu sur la mécanosensibilité de cellules de cancer du côlon humains primaires in vitro. Ici, un protocole optimisé est développé qui décrit l'isolement de cellules du colon à partir d'échantillons humains primaires saines et cancéreuses tissus humains chirurgicales. Les cellules du côlon isolés sont ensuite cultivés avec succès sur le doux (2 kPa raideur) et rigide (10 kPa raideur) hydrogels de polyacrylamide et polystyrène rigide (~ 3,6 GPa de rigidité) substrats fonctionnalisés par une matrice extracellulaire (fibronectinedans ce cas). Les microbilles fluorescentes sont incorporées dans des gels mous à proximité de la surface de culture cellulaire, et essai de traction est effectué pour évaluer les contraintes de contraction cellulaire en utilisant le logiciel d'accès ouvert libre. En outre, la microscopie d'immunofluorescence sur des substrats différents de rigidité fournit des informations utiles sur la morphologie de la cellule primaire, l'organisation du cytosquelette et la vinculine contenant adhésions focales en fonction de la rigidité substrat.

Introduction

Au cours des dernières années, il est devenu de plus en plus évident que les micro-environnement mécanique, en plus des facteurs biochimiques, joue un rôle important dans la régulation des fonctions cellulaires. Les cellules peuvent détecter et de répondre à la rigidité du substrat sur lequel elles sont respectées (comme dans la culture 2D) ou entourées par (comme dans la culture 3D) ^7.3. En faisant cela, les cellules peuvent moduler leur différenciation ^{3, 4} morphologie, la migration / mobilité ^5, biophysiques propriétés ^{6, 7} croissance, et d'autres processus.

Les cellules cancéreuses rép....