Génération efficace de hiPSC neurones Lineage Reporters Knockin spécifique en utilisant l&#39;CRISPR / Cas9 et Cas9 Système Double Nickase

Shenglan Li; Haipeng Xue; Bo Long; Li Sun; Tai Truong; Ying Liu

doi:10.3791/52539

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Article de méthode

Génération efficace de hiPSC neurones Lineage Reporters Knockin spécifique en utilisant l'CRISPR / Cas9 et Cas9 Système Double Nickase

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DOI :

10.3791/52539

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28 mai 2015

Shenglan Li^*¹^,² , Haipeng Xue^*¹^,² , Bo Long¹^,²^,⁵ , Li Sun¹^,²^,⁶ , Tai Truong¹^,²^,⁴^,⁷ , Ying Liu¹^,²^,³

¹Department of Neurosurgery, The University of Texas Health Science Center at Houston, ²Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, Brown Foundation Institute of Molecular Medicine, The University of Texas Health Science Center at Houston, ³The Senator Lloyd & B. A. Bentsen Center for Stroke Research, Brown Foundation Institute of Molecular Medicine, The University of Texas Health Science Center at Houston, ⁴Summer Research Program, Office of Educational Programs, The University of Texas Health Science Center at Houston, ⁵Department of Anesthesiology, Shengjing Hospital, China Medical University, ⁶Department of Oncology, Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, ⁷Biology Department, University of West Georgia

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Les outils d’édition du génome tels que le système CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (associé à CRISPR) ont considérablement amélioré l’efficacité du ciblage génique dans les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC). Ce manuscrit décrit un protocole permettant de générer un rapporteur hiPSC spécifique à la lignée à l’aide de la recombinaison homologue assistée par le système CRISPR/Cas.

Résumé

Le ciblage génétique est une approche essentielle pour caractériser les fonctions des gènes dans la recherche biomédicale moderne. Cependant, l’efficacité du ciblage génique dans les cellules humaines a été faible, ce qui empêche la génération de lignées cellulaires humaines à un rythme souhaité. Au cours des deux dernières années, on a assisté à une progression rapide de l’amélioration de l’efficacité de la manipulation génétique par des outils d’édition du génome tels que le système CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated). Ce manuscrit décrit un protocole permettant de générer des rapporteurs de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) spécifiques à la lignée à l’aide de la recombinaison homologue assistée par le système CRISPR/Cas. Les procédures d’obtention des composants nécessaires à la fabrication de lignées neuronales à l’aide du système CRISPR/Cas, en se concentrant sur la construction de vecteurs de ciblage et d’ARN guides uniques, sont décrites. Ce protocole peut être étendu à l’établissement de plateformes et à la correction de mutations dans les hiPSC.

Introduction

Le système CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (associé à CRISPR), associé à d’autres outils d’édition du génome, a révolutionné la manipulation du génome humain au cours des dernières années^1-7. Les principaux composants du système CRISPR/Cas9 sont l’ARN guide unique (ARNsg) et Cas9. Cas9 est une endonucléase d’ADN de type II guidée par l’ARN. Il possède deux domaines de nucléases, HNH et RuvC, qui sont responsables de la fabrication de cassures double brin de l’ADN (DSB) dans une région génomique spécifique à côté d’un motif adjacent protospacer (PAM)^7-10. Un ARNsg a une fonction combinée de celle de l’ARNcr et de l’ARNtracr, deux....