Immunohistochemie en Multiple Labeling met antilichamen van dezelfde Host te onderzoeken soorten volwassen hippocampus Neurogenese
Summary
This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.
Abstract
Volwassen neurogenese is een sterk gereguleerd, meertraps proces waarbij nieuwe neuronen worden gegenereerd uit een geactiveerde neurale stamcel via steeds gecommitteerde tussenliggende progenitor subtypes. Elk van deze subtypen drukt een reeks specifieke moleculaire merkers die, samen met specifieke morfologische criteria, kunnen worden gebruikt voor hun identificatie. Typisch worden immunofluorescentie technieken toegepast waarbij subtype-specifieke antilichamen in combinatie met exo- of endogene proliferatiemerkers. We beschrijven hierin immunokleuring werkwijzen voor de detectie en kwantificering van alle stadia van volwassen hippocampale neurogenese. Deze bestaan uit de toepassing van thymidine-analogen, transcardial perfusie, weefsel verwerking, warmte-geïnduceerde epitoopversterking, ABC immunohistochemie, meerdere indirecte immunofluorescentie, confocale microscopie en cel kwantificering. Verder presenteren we een sequentiële multipele immunofluorescentie protocol welke problemen u omzeiltsually voortvloeien uit de noodzaak van het gebruik van primaire antilichamen opgewekt in dezelfde soort gastheer. Het maakt het mogelijk een nauwkeurige identificatie van alle hippocampus voorlopercellen subtypen samen met een wildgroei marker binnen één sectie. Deze technieken zijn een krachtig instrument om de regelgeving van de diverse voorlopercellen subtypes in parallel, hun betrokkenheid bij de hersenen pathologieën en hun rol in specifieke hersenfuncties te bestuderen.
Introduction
Twee hersengebieden constitutief het genereren van nieuwe neuronen gedurende het hele leven, de subventriculaire zone van de laterale ventrikels en de subgranulaire zone (SGZ) van de hippocampus dentate gyrus (DG). De pasgeboren neuronen afkomstig van neurale stamcellen en gaan door verschillende stadia van de morfologische en fysiologische ontwikkeling vóór het bereiken van volwassenheid 1,2. Van een langzaam delende radiale glia-achtige stamcel (type 1) opeenvolgende stadia van doorvoer versterken tussenliggende voorlopercellen ontstaan. Hoe meer ongedifferentieerde subtypes (type 2a en het type 2b) hebben een onregelmatige vorm met korte, tangentiële processen. Zij genereren neuroblasts (type 3) de celcyclus verlaten geleidelijk aan onvolwassen neuronen (met dendrieten uitgebreid tot de moleculaire laag) en tenslotte integreren in de hippocampus netwerk rijpe granule cellen. Vanwege hun bijzondere fysiologische eigenschappen van deze cellen de schakelingen met verhoogde plasticiteit 3 suggesting een unieke rol in de hippocampus functie. Eigenlijk, studies van de laatste tien jaar substantieel bewijs dat volwassen neurogenese bijdraagt aan ruimtelijk geheugen, patroon scheiding en emotioneel gedrag 4,5 gegenereerd.
Volwassen neurogenese kan worden bestudeerd met behulp van verschillende benaderingen. Thymidine analogen nemen in DNA tijdens de S-fase van de celcyclus en mogelijk geboorte dating, kwantificering en lot analyse van pasgeboren cellen 6-8. Opeenvolgende toepassing van verschillende thymidine analogen (bv CldU, edu of IDU) kan worden gebruikt voor celvernieuwing of celpopulaties geboren op verschillende tijdstippen in de loop van een experiment 9 bestuderen. Een alternatief, endogene marker voor celproliferatie is Ki67. Het wordt uitgedrukt in delende cellen gedurende alle fasen van de celcyclus (G1, S, G2, M), behalve de rustfase (G0) en begin G1 10,11. Om het fenotype van de pasgeboren celpopulaties analyseren de volwassen dentate gyrus verschillende fase-specifieke moleculaire markers kunnen worden gebruikt, zoals GFAP, nestine, DCX en NeuN 1,6. GFAP is een merker rijpe astrocyten maar zich ook in radiale glia-achtige cellen in de volwassen voorhersenen. Nestin een intermediair filament specifiek voor radiale glia-achtige cellen en vroege tussenproduct progenitorcellen. DCX is een microtubule geassocieerde eiwit expressie intermediair progenitors, neuroblasts en onvolwassen neuronen. Op basis van de (co-) expressie van deze drie markers en de morfologische kenmerken van de gelabelde cellen vier verschillende progenitorcel subtypen worden onderscheiden: type 1 (GFAP +, nestine +, DCX -), het type 2a (GFAP -, nestine + , DCX -), het type 2b (GFAP -, nestine +, DCX +) en type 3 (GFAP -, nestine -, DCX +) 1. Co-etikettering van DCX met NeuN, dat wordt uitgedrukt in postmitotische neuronen, maakt de differentiatie van immature (DCX +, NeuN +) en volwassen (DCX -, NeuN +) korrel neuronen.
De hierboven vermelde merkers worden vaak gebruikt voor immunofluorescentie co-labeling en daaropvolgende confocale microscopie met het aantal en de identiteit van pasgeboren cellen geanalyseerd. Dit vereist gewoonlijk antilichamen van verschillende gastheersoorten ongewenste antilichaam kruisreactiviteit voorkomen. De meeste primaire antilichamen geschikt voor neurogenese onderzoek worden gebracht hetzij in konijnen of muizen (bijvoorbeeld muizen α-BrdU, muis α-NeuN, konijn α-Ki67, konijn α-GFAP). Dit leidt tot ernstige beperkingen in het aantal en de combinatie van antigenen die in één segment kan worden geëvalueerd. Hierdoor verhoogt niet alleen de kleuring inspanning, als meervoudige kleuringen moeten worden uitgevoerd, maar kan ook gevaar opleveren voor de betrouwbaarheid van de resultaten. Bovendien zijn sommige antigenen zijn gevoelig voor formaline-fixatie geïnduceerde epitoop maskeren (bijvoorbeeld Ki67, Nestine). We beschrijven hierin wijzigingen van de klassieke enkelvoudige als meervoudige immunokleuring protocollen (bijvoorbeeld epitoop, meerdere opeenvolgende immunokleuring, gebruik van nestin-GFP transgene muizen 12) dat veel van deze problemen overwinnen. Met name de sequentiële multipele immunofluorescentie kleuring protocol maakt tegen maximaal vier verschillende antigenen, zelfs indien een deel van de antilichamen afgeleid van dezelfde gastheer. Dit maakt de gelijktijdige detectie van het type 1, type 2a, het type 2b en type 3 progenitorcellen, alsook hun proliferatie activiteit in één sectie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kwantificering en identificatie van subpopulaties van pasgeboren cellen is een centraal thema in het volwassen neurogenese onderzoek. De combinatie van proliferatie markers en antilichamen tegen eiwitten die tijdens bepaalde stadia van volwassen neurogenese maakt immunohistochemische detectie van deze subpopulaties. Sommige antilichamen of antilichaam combinaties vereisen specifieke kleuring omstandigheden.
Labeling van delende cellen met synthetische thymidine analogen nog steeds de gouden …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank S. Tausch for excellent technical assistance. The work was supported by BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) and DFG (FOR1738).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments & Dilutions |
| Thymidine analog administration | |||
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | MP Biomedicals | 2105478 | |
| 5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU | MP Biomedicals | 2100357 | |
| Tissue preparation | |||
| Isoflurane-Actavis | Piramal Healthcare | 700211 | |
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Riedel-De Häen | 16005 | toxic, flammable |
| Perfusion pump PD5206 | Heidolph Instruments | 523-52060-00 | |
| Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm | Thermo Fischer Scientific | 06409-13 | |
| Feeding needle, straight, 21G, 1.75mm olive tip, 40mm | Agnthos | 1036 | |
| Freezing microtome Microm HM 400 | Thermo Fischer Scientific | ||
| 24 Well Cell Culture Multiwell Plates | Greiner Bio-One | 662160 | |
| Immunohistochemistry | |||
| Tefal Vitacuisine Steamer | Tefal | VS 4001 | |
| Netwell 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 6-Well Culture Plates | Corning | 3479 | |
| Netwell 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates | Corning | 3477 | |
| Netwell Plastic 6-Well Carrier Kit for 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts | Corning | 3521 | |
| Netwell Plastic 12-Well Carrier Kit for 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts | Corning | 3520 | |
| Vectastain Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) | Sigma-Aldrich | D-5637 | carcinogenic, light sensitive |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Primary antibodies | |||
| rabbit IgG1 α-Ki67 | Novocastra/ Leica Biosystems | NCL-L-Ki67MM1 | DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval |
| rabbit α-GFAP, AS-3-GF | Synaptic Systems | 173 002 | 1:500 |
| goat IgG (H+L) α-GFP | Acris Antibodies | R1091P | 1:300 |
| mouse IgG1 α-nestin | Abcam | ab6142 | 1:200; requires epitope retrieval |
| guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin | Merck Millipore | AB2253 | 1:500 |
| rat IgG2a α-BrdU (ascites) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030CX | for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400 |
| rat IgG2a α-BrdU (purified) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030 | for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400 |
| mouse IgG1ĸ α-BrdU | BD Biosciences | 347580 | for detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350 |
| mouse IgG1 α-NeuN | Merck Millipore | MAB377 | 1:500 |
| Secondary antibodies | |||
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 711-065-152 | 1:500 |
| donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 712-065-150 | 1:500 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 715-065-151 | 1:500 |
| goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | 1:250 |
| donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11055 | 1:250 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment | Dianova | 715-097-003 | 1:100 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 715-605-151 | 1:250 |
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 706-605-148 | 1:250 |
| donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 712-295-150 | 1:250 |
| donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 711-295-152 | 1:250 |
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 706-296-148 | 1:250 |
| Streptavidin-Rhodamine Red-X | Dianova | 016-290-084 | 1:500 |
| goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA | Dianova | 111-155-144 | 1:250, works only with rabbit α-GFAP |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H3570 | 1:1000 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:1000 |
| Blocking | |||
| Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) | Dianova | 715-007-003 | 1:20 |
| Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) | Dianova | 711-007-003 | 1:20 |
| Normal donkey serum | Merck Millipore | S30 | |
| Normal rabbit serum | Dianova | 011-000-010 | |
| Normal goat serum | Dianova | 005-000-001 | |
| Bovine Serum Albumine | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Histology | |||
| Cresyl violett | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Neo-Clear | Merck Millipore | 109843 | non-toxic xylene substitute |
| Neo-Mount | Merck Millipore | 109016 | permanent mounting medium |
| Microscopy | |||
| Axioskop 2 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy |
References
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).
- Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).
- Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain. Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).
- Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research. Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).
- Encinas, J. M., Enikolopov, G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).
- Burns, K. A., Kuan, C. Y. Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus. Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).
- Cameron, H. A., McKay, R. D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
- Vega, C. J., Peterson, D. A. Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination. Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).
- Brown, D. C., Gatter, K. C. Ki67 protein: the immaculate deception. Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).
- Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).
- Sicinski, P., et al. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis. Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).
- Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2. BMC Neurosci. 13, 46 (2012).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).
- Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).
