Immunohistokemi och Multiple Märkning med antikroppar från samma värdart att studera Adult hippocampus Neurogenesis
Summary
This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.
Abstract
Adult neurogenes är en starkt reglerad, flerstegsprocess där nya nervceller genereras från en aktiverad neural stamcell via alltmer engagerade mellangångar subtyper. Var och en av dessa subtyper uttrycker en uppsättning särskilda molekylära markörer som, tillsammans med specifika morfologiska kriterier, kan användas för att identifiera. Normalt är immunofluorescerande teknik tillämpas involverar subtyp-specifika antikroppar i kombination med exo- eller endogena spridningsmarkörer. Vi beskriver häri immunomärkning metoder för påvisande och kvantifiering av alla stadier av vuxen hippocampus neurogenes. Dessa består av tillämpningen av tymidinanaloger, transcardial perfusion, mjukpapper bearbetning, värme epitopretrieval, ABC immunohistokemi, multipel indirekt immunofluorescens, konfokalmikroskopi och cell kvantifiering. Dessutom presenterar vi en sekventiell multipel immunofluorescens protokoll som kringgår problemen usually härrör från behovet av att använda primära antikroppar som tas upp i samma värdarter. Det gör en korrekt identifiering av alla hippocampus gångar subtyper tillsammans med en spridning markör inom ett enda avsnitt. Dessa tekniker är ett kraftfullt verktyg för att studera regleringen av olika gångar subtyper parallellt, deras deltagande i hjärn patologier och deras roll i specifika hjärnfunktioner.
Introduction
Två hjärnregioner konstitutivt generera nya nervceller under hela livet, den subventrikulära zonen av de laterala ventriklarna och subgranular zonen (SGZ) i hippocampus gyrus dentatus (GD). De nyfödda nervceller härrör från neurala progenitorceller och gå igenom olika stadier av morfologiska och fysiologiska utveckling innan den når mognad 1,2. Från ett långsamt dela radiell glia liknande stamcell (typ 1) på varandra följande steg transit förstärka mellan progenitorceller uppstår. De mer odifferentierade subtyper (typ 2a och typ 2b) har en oregelbunden form med korta, tangentiella processer. De genererar neuroblaster (typ 3) som gradvis lämna cellcykeln blir omogna nervceller (med dendriter utsträckt mot den molekylära skikt) och slutligen integreras i hippocampus nätverk som mogna granulceller. På grund av deras särskilda fysiologiska egenskaper dessa celler ger kretsen med förbättrade plasticitet 3 suggesting en unik roll i hippocampus funktion. Egentligen studier av det senaste decenniet genererade betydande bevis för att vuxna neurogenes bidrar till rumsliga minne, mönster separation och emotionella beteenden 4,5.
Adult neurogenes kan studeras med hjälp av olika metoder. Tymidinanaloger införliva i DNA under S-fasen av cellcykeln och låta födelse dejting, kvantifiering och öde analys av nyfödda celler 6-8. Sekventiell tillämpning av olika tymidinanaloger (t.ex. CldU, EDU eller IDU) kan användas för att studera cellomsättning eller cellpopulationer födda vid olika tidpunkter under ett experiment 9. Ett alternativ, endogen markör för celltillväxt är Ki67. Den uttrycks i delande celler under alla faser av cellcykeln (G1, S, G2, M) förutom vilofasen (G0) och början av G1 10,11. För att analysera fenotypen av nyfödda cellpopulationer i den vuxna dentate gyrus flera stadiespecifika molekylära markörer kan användas, såsom GFAP, nestin, DCX och NeuN 1,6. GFAP är en markör av mogna astrocyter men uttrycks också i radiella glia-liknande celler i den vuxna framhjäman. Nestin är en mellanfilament specifikt för radiella glia-liknande celler och tidiga mellan progenitorceller. DCX är en mikrotubuli-associerat protein som uttrycks i mellan progenitorceller, neuroblaster och omogna nervceller. Baserat på den (med) uttryck av dessa tre markörer och de morfologiska egenskaperna hos de märkta cellerna fyra distinkta progenitorceller subtyper kan identifieras: typ 1 (GFAP +, nestin +, DCX -), typ 2a (GFAP -, nestin + , DCX -), typ 2b (GFAP -, nestin +, DCX +) och typ 3 (GFAP -, nestin -, DCX +) 1. Co-märkning av DCX tillsammans med NeuN, som uttrycks i postmitotiska nervceller tillåter differentiering av immature (DCX +, Neun +) och mogna (DCX -, Neun +) granulat nervceller.
De ovan nämnda markörer används ofta för immunfluorescerande samarbete märkning och efterföljande konfokalmikroskopi att analysera antal och identitet nyfödda celler. Detta kräver typiskt antikroppar från olika värdarter att förhindra oönskad antikropp korsreaktivitet. Dock är majoriteten av primära antikroppar lämpliga för neurogenes forskning upp antingen i kaniner eller möss (t.ex. mus α-BrdU, mus α-NeuN, kanin α-Ki67, kanin α-GFAP). Detta leder till allvarliga begränsningar i antalet och kombinationen av antigener som kan utvärderas i en enda skiva. Detta i sin tur ökar inte bara färgning ansträngning, som flera färgningar måste utföras, men kan också äventyra resultatens tillförlitlighet. Dessutom kan vissa antigener är mottagliga för formalinfixering-inducerad epitop maskering (t.ex. Ki67, Nestin). Vi beskriver häri modifieringar från de klassiska enkel- och multipel immunomärkning protokoll (t.ex. epitopretrieval, multipel sekventiell immunfärgning, användning av nestin-GFP transgena möss 12) som övervinna många av dessa frågor. I synnerhet tillåter processerna med flera immunofluorescens protokoll färgning mot upp till fyra olika antigener, även om en del av antikropparna härrör från samma värd. Detta möjliggör samtidig detektion av typ 1, typ 2a, typ 2b och typ 3 progenitorceller, såväl som deras proliferativa aktivitet inom en enda sektion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kvantifiering och identifiering av subpopulationer av nyfödda celler är en central fråga i vuxen neurogenes forskning. Kombinera spridning markörer och antikroppar mot proteiner som uttrycks under vissa stadier av vuxenneurogenes medger immunhistokemisk detektion av dessa subpopulationer. Några av antikroppar eller kombinationer antikropps kräver särskilda färgningsförhållanden.
Märkning av delande celler med syntetiska tymidinanaloger är fortfarande den gyllene standarden för a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank S. Tausch for excellent technical assistance. The work was supported by BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) and DFG (FOR1738).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments & Dilutions |
| Thymidine analog administration | |||
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | MP Biomedicals | 2105478 | |
| 5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU | MP Biomedicals | 2100357 | |
| Tissue preparation | |||
| Isoflurane-Actavis | Piramal Healthcare | 700211 | |
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Riedel-De Häen | 16005 | toxic, flammable |
| Perfusion pump PD5206 | Heidolph Instruments | 523-52060-00 | |
| Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm | Thermo Fischer Scientific | 06409-13 | |
| Feeding needle, straight, 21G, 1.75mm olive tip, 40mm | Agnthos | 1036 | |
| Freezing microtome Microm HM 400 | Thermo Fischer Scientific | ||
| 24 Well Cell Culture Multiwell Plates | Greiner Bio-One | 662160 | |
| Immunohistochemistry | |||
| Tefal Vitacuisine Steamer | Tefal | VS 4001 | |
| Netwell 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 6-Well Culture Plates | Corning | 3479 | |
| Netwell 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates | Corning | 3477 | |
| Netwell Plastic 6-Well Carrier Kit for 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts | Corning | 3521 | |
| Netwell Plastic 12-Well Carrier Kit for 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts | Corning | 3520 | |
| Vectastain Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) | Sigma-Aldrich | D-5637 | carcinogenic, light sensitive |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Primary antibodies | |||
| rabbit IgG1 α-Ki67 | Novocastra/ Leica Biosystems | NCL-L-Ki67MM1 | DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval |
| rabbit α-GFAP, AS-3-GF | Synaptic Systems | 173 002 | 1:500 |
| goat IgG (H+L) α-GFP | Acris Antibodies | R1091P | 1:300 |
| mouse IgG1 α-nestin | Abcam | ab6142 | 1:200; requires epitope retrieval |
| guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin | Merck Millipore | AB2253 | 1:500 |
| rat IgG2a α-BrdU (ascites) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030CX | for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400 |
| rat IgG2a α-BrdU (purified) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030 | for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400 |
| mouse IgG1ĸ α-BrdU | BD Biosciences | 347580 | for detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350 |
| mouse IgG1 α-NeuN | Merck Millipore | MAB377 | 1:500 |
| Secondary antibodies | |||
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 711-065-152 | 1:500 |
| donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 712-065-150 | 1:500 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 715-065-151 | 1:500 |
| goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | 1:250 |
| donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11055 | 1:250 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment | Dianova | 715-097-003 | 1:100 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 715-605-151 | 1:250 |
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 706-605-148 | 1:250 |
| donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 712-295-150 | 1:250 |
| donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 711-295-152 | 1:250 |
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 706-296-148 | 1:250 |
| Streptavidin-Rhodamine Red-X | Dianova | 016-290-084 | 1:500 |
| goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA | Dianova | 111-155-144 | 1:250, works only with rabbit α-GFAP |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H3570 | 1:1000 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:1000 |
| Blocking | |||
| Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) | Dianova | 715-007-003 | 1:20 |
| Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) | Dianova | 711-007-003 | 1:20 |
| Normal donkey serum | Merck Millipore | S30 | |
| Normal rabbit serum | Dianova | 011-000-010 | |
| Normal goat serum | Dianova | 005-000-001 | |
| Bovine Serum Albumine | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Histology | |||
| Cresyl violett | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Neo-Clear | Merck Millipore | 109843 | non-toxic xylene substitute |
| Neo-Mount | Merck Millipore | 109016 | permanent mounting medium |
| Microscopy | |||
| Axioskop 2 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy |
References
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).
- Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).
- Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain. Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).
- Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research. Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).
- Encinas, J. M., Enikolopov, G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).
- Burns, K. A., Kuan, C. Y. Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus. Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).
- Cameron, H. A., McKay, R. D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
- Vega, C. J., Peterson, D. A. Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination. Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).
- Brown, D. C., Gatter, K. C. Ki67 protein: the immaculate deception. Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).
- Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).
- Sicinski, P., et al. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis. Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).
- Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2. BMC Neurosci. 13, 46 (2012).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).
- Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).
