التصميم ومعالجة السطوح، التصفيحات الخلوية، والتثقيف من وحدات الشبكات العصبية تتكون من الدوائر وظيفيا بين اتصال
Summary
توضح هذه المخطوطة بروتوكول لتنمو في الشبكات وحدات المختبر يتكون من محصورة مكانيا، وظيفيا المترابطة الدوائر العصبية. ويستخدم قناع البوليمرية لنمط طبقة البروتين لتعزيز التصاق الخلايا على الركيزة زراعة. الخلايا العصبية مطلي تنمو على المناطق المغلفة إقامة صلات عفوية وعرض النشاط الكهربية.
Abstract
يعمل الدماغ من خلال تفعيل التنسيق والتواصل الديناميكي المجالس العصبية. سؤال مفتوح الرئيسي هو كيف ذخيرة واسعة من الزخارف الديناميكية، التي تكمن وراء وظائف المخ الأكثر تنوعا، يمكن أن يخرج من منظمة الطوبوغرافية وحدات ثابتة من الدوائر الكهربائية في المخ. مقارنة في الدراسات المجراة الدوائر العصبية التي تمثل الصعوبات التجريبية الجوهرية، والأعمال التحضيرية في المختبر توفر إمكانية أكبر بكثير للتلاعب وتحقيق خصائص الهيكلية، والديناميكية والكيميائية للأنظمة العصبية التجريبية. يصف هذا العمل منهجية تجريبية في المختبر الذي يسمح متزايد من الشبكات وحدات ألحان متميزة مكانيا، والجمعيات الخلايا العصبية المترابطة وظيفيا. بروتوكول يسمح السيطرة على ثنائية الأبعاد (2D) الهندسة المعمارية للشبكة العصبية على مستويات مختلفة من التعقيد الطوبوغرافية.
والزخرفة الشبكة المطلوبة يمكن أن يكونحقق كل من زلات غطاء العادية والركيزة جزءا لا يتجزأ من صفائف الكهربائي الصغير. وتنقش الهياكل مجهريا على رقاقة السيليكون وتستخدم لخلق الإستنسل البوليمرية حيويا، التي تتضمن الميزات السلبية للبنية الشبكة المطلوبة. يتم وضع الإستنسل على ركائز زراعة أثناء إجراء طلاء السطح بطبقة الجزيئية لتعزيز التصاق الخلوية. بعد إزالة الإستنسل، ومطلي الخلايا العصبية، وأنها توجيهها تلقائيا إلى المناطق المغلفة. من خلال خفض المسافة بين المقصورة، فمن الممكن الحصول على الدوائر العصبية إما معزولة أو مترابطة. لتعزيز بقاء الخلية، الخلايا شارك في تربيتها مع شبكة الخلايا العصبية دعم الذي يقع في المحيط الخارجي للصحن الثقافة. وتعرض التسجيلات الكهربية والضوئية لنشاط الشبكات وحدات الحصول على التوالي باستخدام الركيزة جزءا لا يتجزأ من صفائف الكهربائي الصغير والتصوير الكالسيوم. بينما تظهر كل وحدة مذكورة عفوياتزامن العالمية aneous، وينظم وقوع المشتركة بين وحدة المزامنة كثافة اتصال بين الدوائر.
Introduction
الأدلة التجريبية والنظرية تدعم إمكانية أن الدماغ يعمل من خلال تفعيل منسقة المجالس خلية 1-5، والتي يمكن اعتبارها وحدات وظيفية الديناميكية التي تتفاعل بشكل عابر مع بعضها البعض لتشكيل والكامنة الدول الدماغ المختلفة. نمطية وظيفي هو أيضا يعتمد على والمرتبطة بتنظيم وحدات الهيكلية للدوائر الدماغ 6،7. كيف ظيفة وبنية الدوائر الكهربائية في المخ تشكيل كل منهما الآخر لا يزال واحدا من الأسئلة المفتوحة الرئيسية في علم الأعصاب. لتوفير فهم أعمق لهذا السؤال، فمن المهم تحديد الأطر التجريبية الأمثل حيث أنه من الممكن أن تتناول، جزئيا على الأقل، وتلك القضايا. منذ تسيطر التلاعب في ديناميات المكانية والزمانية للشبكات العصبية في التجارب في الجسم الحي هو التحدي، وتطوير شبكات الخلايا العصبية في المختبر نماذج ذات اهتمام بسبب سهولة لجنة التنسيق الإدارية الخاصةessibility، والرصد، والتلاعب والنمذجة 8،9. في السنوات الأخيرة، قد سمحت في تقنيات المختبر بدعم من أساليب الزخرفة الركيزة المتقدمة للحث على الشبكات العصبية لتطوير مجموعة من الهياكل وحدات محددة مسبقا 3 ودراسة الخصائص الفنية للشبكات مع طبولوجيا فرض 10. على وجه الخصوص، استخدمت أساليب مؤخرا لتنظيم شبكات من خلال فرض القيود المادية 4،11. في الواقع، لدراسة العلاقة بين البنية والوظيفة في الشبكات العصبية وتوفير تمثيل مبسط لكن معقول من التفاعل المجالس العصبية، يجب في المختبر النظم أن توفر مترابطة الخلايا العصبية السكان الفرعية. درس على نطاق واسع 2D الثقافات العصبية متجانسة لا تفرض أي قيود مكانية على التنظيم الذاتي الأسلاك الناشئة من الدوائر. لذلك نهجا الممكن تشكيل المجالس خلية مترابطة بشكل مصطنع هو موقف مختلف السكان العصبية في الخلافمجالات متميزة ially. المسافة بين هذه المناطق لا يمنع الاتصالات بين المجالس. هذا النهج، مع ضمان سيطرة كبيرة على تعقيد الشبكة، وقد تبين لتوفير ذخيرة غنية من النماذج تزامن 6،7،12.
من أجل تسهيل زراعة استنساخه المجالس العصبية وحدات، وبروتوكول لتجميع التنظيم الذاتي للشبكات في مجموعات الخلايا العصبية التي ربطها محاور عصبية والتشعبات يرد وصفها. تم إنشاء هيكل البوليمرية لالحبس المادي للثقافات العصبية من (PDMS) polydimtheylsiloxane. PDMS هو المطاط الصناعي تستخدم على نطاق واسع للتطبيقات الطبية الحيوية نظرا لفي توافق مع الحياة، والشفافية، والنفاذية للغازات 13. تم إعداد PDMS واستبعادها من SU8 مجهريا 2075 14،15 الهياكل من قبل PDMS السائلة إلى "سيد" كما هو موضح سابقا في جاكمان وآخرون طلاء زيادة ونقصان. 16 Tحقق نمط وتتكون من وحدات مترابطة من حجم مختلف الشبكات العصبية، وأنها قد تم الحصول عليها بنجاح على كلا coverslips ومايكرو الكهربائي صالحة (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف) 17-20. كثافة الاتصالات بين وحدات يمكن أن تتغير ملامح تزامن الشبكة، من شبكة متزامنة تماما، نموذجية من الثقافات موحدة، إلى دول عابرة التزامن بين الوحدات.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوصف بروتوكول لتنمو 2D الشبكات العصبية في المختبر وحدات تتألف من الدوائر مترابطة وظيفيا. ويستند هذا الإجراء على الزخرفة طبقة لاصقة الخلوية. ويتحقق الزخرفة مع PDMS الإستنسل استنساخ ميزة سلبية للبنية الشبكة المطلوبة. الإستنسل PDMS تحدد المناطق التي يتم فيها إيداع طبق…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل مشروع BRIANBOW الأوروبي (FP7- يونغ المستكشفين، فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور جاكوبو Tessadori لتعليقات مفيدة على المخطوطة، وسيلفيا Chiappalone لمساعدتها في إنتاج الرسومات المستخدمة في الفيديو.
Materials
| PDMS, Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| Nalgene Vacuum Chamber | Thermo | 5305-0609 | |
| Poly-D-Lysine PDL | Sigma | P7886 | |
| silicone grease – SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| Spin Coater | Laurell – Technologies Corporation | WS-650-23 | |
| 12 well culture plate | Sigma | CLS3336 | |
| 5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| silicone grease – SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
| TC02 | Multi Channel Systems | ||
| Pen Strep | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1c | |
| B-27 | Gibco | 17504044 | |
| glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| MEM Minimum Essential Medium-Eagle | Biological Industries Beit Haemek | 01-025-1B | |
| Micro Electrode Arrays 4Q | Multi Channel Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr | cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com |
| silicon wafer | microchem | SU8-2075 | Preparation protocol: www.microchem.com |
References
- Buzsaki, G. Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68, 362-385 (2010).
- Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. Modular and hierarchically modular organization of brain networks. Frontiers in Neuroscience. 4, 200 (2010).
- Levy, O., Ziv, N. E., Marom, S. Enhancement of neural representation capacity by modular architecture in networks of cortical neurons. European Journal of Neuroscience. 35, 1753-1760 (2012).
- Berdondini, L., et al. A microelectrode array (MEA) integrated with clustering structures for investigating in vitro neurodynamics in confined interconnected sub-populations of neurons. Sensors and Actuators B-Chemical. 114, 530-541 (2006).
- Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PloS One. 9, e107400 (2014).
- Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Innate synchronous oscillations in freely-organized small neuronal circuits. PloS One. 5, e14443 (2010).
- Shein-Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Engineered neuronal circuits: a new platform for studying the role of modular topology. Frontiers in Neuroengineering. 4, 10 (2011).
- Bonifazi, P., et al. In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses. Front Neural Circuits. 7, 40 (2013).
- Jungblut, M., Knoll, W., Thielemann, C., Pottek, M. Triangular neuronal networks on microelectrode arrays: an approach to improve the properties of low-density networks for extracellular recording. Biomedical Microdevices. 11, 1269-1278 (2009).
- Marconi, E., et al. Emergent functional properties of neuronal networks with controlled topology. PloS One. 7, e34648 (2012).
- Taylor, A. M., Jeon, N. L. Microfluidic and compartmentalized platforms for neurobiological research. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39, 185-200 (2011).
- Sorkin, R., et al. Compact self-wiring in cultured neural networks. J Neural Eng. 3, 95-101 (2006).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical micro/nanosystems. Biomedical Microdevices. 7, 281-293 (2005).
- Campo, A. G. C. SU-8: a photoresist for high-aspect-ratio and 3D submicron lithography. Journal of Micromechanics and MicroengineeringEmail alert RSS feed. 17, 81-95 (2007).
- Liu, G. T. Y. Kan Y Fabrication of high-aspect-ratio microstructures using SU8 photoresist. Microsystem Technologies. 11, 343-346 (2005).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15, 2973-2984 (1999).
- Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 2, 19-31 (1980).
- Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. New Fixed-Array Multi-Microelectrode System Designed for Long-Term Monitoring of Extracellular Single Unit Neuronal-Activity In vitro. Neuroscience Letters. 6, 101-105 (1977).
- Gross, G. W., Williams, A. N., Lucas, J. H. Recording of spontaneous activity with photoetched microelectrode surfaces from mouse spinal neurons in culture. Journal of Neuroscience Methods. 5, 13-22 (1982).
- Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74, 61-66 (1972).
- Herzog, N., Shein-Idelson, M., Hanein, Y. Optical validation of in vitro extra-cellular neuronal recordings. J Neural Eng. 8, 056008 (2011).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177, 241-249 (2009).
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab Chip. 9, 404-410 (2009).
- Georger, J. H., et al. Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth. Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).
- Torimitsu, K., Kawana, A. Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture. Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).
- Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks. Medical & Biological Engineering & Computing. 36, 135-141 (1998).
- Petrelli, A., et al. Nano-volume drop patterning for rapid on-chip neuronal connect-ability assays. Lab on a Chip. 13, 4419-4429 (2013).
- Boehler, M. D., Leondopulos, S. S., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Hippocampal networks on reliable patterned substrates. Journal of Neuroscience Methods. 203, 344-353 (2012).
