Design, Oberflächenbehandlung, Cellular-Überzug und Kultivierung von Modular Neuronale Netze Bestehend aus Funktionell mit Inter-Schaltungen
Summary
Diese Handschrift beschreibt ein Protokoll, um in vitro modulare Netzwerke aus räumlich beschränkt, funktionell miteinander verbundenen neuronalen wachsen. Eine Polymermaske zum Strukturieren einer Proteinschicht verwendet, um die zelluläre Adhäsion über die Kultivierungssubstrat zu fördern. Vernickelt Neuronen wachsen auf beschichteten Bereiche Gründung spontane Verbindungen und elektrophysiologische Aktivität zeigen.
Abstract
Das Gehirn funktioniert durch die koordinierte Aktivierung und der dynamischen Kommunikation von Neuronenverbände. Eine wichtige offene Frage ist, wie ein riesiges Repertoire an dynamische Motive, die die verschiedensten Funktionen des Gehirns zugrunde liegen, kann aus einem festen topologischen und modulare Organisation des Gehirns Schaltungen entstehen. Im Vergleich zu in-vivo-Studien der neuronalen Schaltkreise, die intrinsische experimentellen Schwierigkeiten bereitet, bieten in vitro Präparate eine viel größere Möglichkeit zur Manipulation und Sonde die strukturelle, dynamische und chemische Eigenschaften von experimentellen neuronalen Systemen. In dieser Arbeit wird ein in vitro experimentellen Methodik, die den Anbau von modularen Netzwerke von räumlich getrennten, funktionell miteinander verbundenen Neuronenverbände zusammensetzt ermöglicht. Das Protokoll ermöglicht die Steuerung der zweidimensionalen (2D) Architektur des neuronalen Netzwerks auf verschiedenen Ebenen der topologische Komplexität.
Eine gewünschte Netzwerk Strukturieren kannsowohl auf den regulären Deckgläser und Substrat eingebettet Mikroelektrodenarrays erreicht. Mikrobearbeiteten Strukturen werden auf einem Siliziumwafer geprägt und verwendet, um biokompatiblen polymeren Matrizen, die die negativen Eigenschaften der gewünschten Netzarchitektur einzubeziehen erstellen. Die Schablonen werden an die Kultivierungssubstraten während des Oberflächenbeschichtungsverfahren mit einer Molekülschicht zur Förderung der Zelladhäsion platziert. Nach dem Entfernen der Schablonen werden Neuronen plattiert und sie spontan auf den beschichteten Bereichen umgeleitet. Durch Verringern des Zwischenraums entfernt, ist es möglich, entweder isoliert oder miteinander verbundenen neuronalen erhalten. Überleben der Zelle zu fördern, sind Zellen co-kultiviert mit einem Stütz neuronalen Netzwerk, das an der Peripherie der Kulturschale angeordnet ist. Elektrophysiologischen und optischen Aufnahmen der Aktivität von modularen Netze jeweils unter Verwendung Substrat eingebettet Mikroelektrodenarrays und Calcium-Bildgebung erhalten werden vorgestellt. Während jedes Modul zeigt spontaneous globalen Synchronisierung, wird das Auftreten von Zwischenmodul-Synchronisation durch die Dichte der Verbindung zwischen den Schaltungen geregelt.
Introduction
Experimentelle und theoretische Beweise unterstützen die Möglichkeit, dass das Gehirn arbeitet durch koordinierte Aktivierung von Zellenanordnungen 1-5, die als dynamische Funktionseinheiten, die vorübergehend miteinander, Formgebung und darunterliegende verschiedene Gehirnzustände in Wechselwirkung angesehen werden kann. Funktionale Modularität ist auch abhängig von und mit der strukturellen modulare Organisation des Gehirns Schaltungen 6,7 verbunden. Wie Funktion und Struktur des Gehirns Schaltungen gegenseitig prägen immer noch eine der wichtigsten offenen Fragen in den Neurowissenschaften. Um ein tieferes Verständnis für diese Frage, ist es wichtig, um eine optimale Versuchs Rahmenbedingungen zu identifizieren, wo es möglich ist, anzugehen, zumindest teilweise, diese Probleme. Da gesteuerte Manipulation der raumzeitlichen Dynamik neuronaler Netzwerke in in vivo Experimenten ist eine Herausforderung, die Entwicklung von in vitro Modellen neuronaler Netzwerke von großem Interesse wegen ihrer einfachen accessibility, Überwachung, Manipulation und Modellierung 8,9. In den letzten Jahren, de von fortgeschrittenen Substratstrukturierungsmethoden unterstützt vitro Technologien erlaubt neuronaler Netze zu veranlassen, eine Reihe von vordefinierten modularen Strukturen 3 zu entwickeln und die funktionellen Eigenschaften von Netzen mit auferlegt Topologien 10 zu studieren. Insbesondere wurden Verfahren vor kurzem verwendet, um Netzwerke von imposanten physischen Beschränkungen 4,11 organisieren. In der Tat, den Zusammenhang zwischen Struktur und Funktion der neuronalen Netze zu untersuchen und eine vereinfachte, aber plausible Darstellung der Interaktion Neuronenverbände bieten, sollten in vitro-Systeme miteinander verbundenen neuronalen Subpopulationen werden. Weitgehend untersucht 2D homogene neuronalen Kulturen keine räumliche Zwänge auferlegen selbstorganisierten emergent Verdrahtung der Schaltkreise. Daher wird ein möglicher Ansatz, um künstlich miteinander verbundenen Zellverbände zu gestalten ist, um verschiedene neuronale Populationen in spuckte positionierenmathematisch verschiedene Bereiche. Der Abstand zwischen diesen Bereichen verhindert nicht, dass die inter-Baugruppen-Verbindungen. Dieser Ansatz, der gleichzeitig ein beträchtliche Kontrolle über die Netzwerkkomplexität, wurde gezeigt, dass eine reichere Repertoire Synchronisationsmodellen 6,7,12 bereitzustellen.
Um eine reproduzierbare Kultivierungs modularer Neuronenverbände zu erleichtern, ein Protokoll, die Selbstorganisation von Netzwerken in neuronale Cluster von Axonen und Dendriten verbunden zu montieren vorgestellt und beschrieben. Die Polymerstruktur zur physikalischen Begrenzung des neuronalen Kulturen aus polydimtheylsiloxane (PDMS) erstellt. PDMS ist ein Elastomer häufig für biomedizinische Anwendungen aufgrund ihrer Biokompatibilität, Transparenz und Durchlässigkeit für Gase 13 verwendet. Das PDMS wird durch Schleuderbeschichtung eine Flüssigkeit PDMS auf einen "Master", wie vorher in Jackman et al. 16 T vorbereitet und von der mikro SU8 ausgeschlossen 2075 14,15 StrukturenEr erreichte gemusterten neuronalen Netzwerke von miteinander verbundenen Modulen unterschiedlicher Größe zusammengesetzt ist, und diese erfolgreich auf beiden Deckgläser und Mikroelektrodenanordnungen (MEAs) 17-20 erhalten wurden. Die Dichte der Verbindungen zwischen den Modulen kann die Eigenschaften der Netzwerksynchronisation zwischen den Modulen zu ändern, von einem vollständig synchronisierten Netzwerks typischen einheitlichen Kulturen, um Übergangszustände von Synchronisation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein Protokoll, um 2D modulare neuronale Netzwerke in vitro funktionell miteinander verbundenen Schaltungen zusammen wachsen beschrieben. Das Verfahren basiert auf Strukturieren einer zellulären Klebeschicht. Strukturierung mit PDMS Schablonen Wiedergabe der negativen Merkmal der gewünschten Netzwerkarchitektur erreicht. PDMS Schablonen definieren die Bereiche, in denen das zellulare Haftschicht abgeschieden wird. Sobald Zellen überzogen, sie spontan versammeln, um den überzogenen Inseln und Selbstorganisati…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Europäischen Projekt BRIANBOW (RP7 Young Explorers unterstützt, möchten die Autoren um Dr. Jacopo Tessadori für nützliche Kommentare zum Manuskript danken und Silvia Chiappalone für ihre Hilfe bei der Erstellung der im Video verwendeten Grafiken.
Materials
| PDMS, Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| Nalgene Vacuum Chamber | Thermo | 5305-0609 | |
| Poly-D-Lysine PDL | Sigma | P7886 | |
| silicone grease – SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| Spin Coater | Laurell – Technologies Corporation | WS-650-23 | |
| 12 well culture plate | Sigma | CLS3336 | |
| 5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| silicone grease – SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
| TC02 | Multi Channel Systems | ||
| Pen Strep | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1c | |
| B-27 | Gibco | 17504044 | |
| glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| MEM Minimum Essential Medium-Eagle | Biological Industries Beit Haemek | 01-025-1B | |
| Micro Electrode Arrays 4Q | Multi Channel Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr | cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com |
| silicon wafer | microchem | SU8-2075 | Preparation protocol: www.microchem.com |
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