この原稿は、空間的に閉じ込められた、機能的に相互接続された神経回路からなる生体外モジュラーネットワークで成長するプロトコルについて説明します。ポリマーマスクは、培養基材上に細胞接着を促進するために、パターンにタンパク質層が使用される。メッキニューロンは、被覆された領域自発的な接続を確立し、電気生理学的活性を示す上で成長。
脳は協調活性化し、神経アセンブリの動的な通信を介して動作します。主要な未解決の問題は、最も多様な脳機能の基礎となる力学モチーフの膨大なレパートリーは、脳回路の固定されたトポロジカルとモジュラー組織の外に出てくることができる方法です。現在の本質的な実験的な困難神経回路のin vivoでの研究と比較して、in vitroでの製剤は、実験的なニューロン系の、構造的な力学的特性および化学的特性を操作し、プローブするための非常に大きな可能性を提供する。この作品は、空間的に異なる、機能的に相互接続された神経細胞の集合体で構成モジュラーネットワークの成長を可能インビトロ実験方法について説明します。プロトコルは、位相的複雑さの異なるレベルでの神経回路網の2次元(2D)アーキテクチャを制御することができる。
目的のネットワークパターニングが可能正規のカバースリップと基板埋め込みマイクロ電極アレイの両方を達成しました。微細加工された構造は、シリコンウエハ上にエンボス加工され、所望のネットワーク·アーキテクチャの負の特徴を含む生体適合性ポリマーステンシルを作成するために使用される。ステンシルは、細胞接着を促進するための分子層を有する表面コーティング手順中に培養基質上に配置される。ステンシルを除去した後、ニューロンは、めっきされ、それらは自然発生的に被覆された領域にリダイレクトする。インターコンパートメント距離を小さくすることにより、それが単離または相互接続されたいずれかの神経回路を得ることができる。細胞生存を促進するために、細胞を培養皿の周囲に配置され、支持神経回路網と共培養する。基板埋め込みマイクロ電極アレイおよびカルシウムイメージングを使用することによってそれぞれ得られたモジュラーネットワークの活性の電気生理学的および光学的記録が提示されている。各モジュールはSPONTを示しているがaneousグローバル同期は、モジュール間の同期の発生は回路間の接続の密度によって調節される。
実験と理論の証拠は、脳が一過お互い、シェーピング、基礎となる別の脳の状態と対話ダイナミック機能ユニットとみなすことができるセルアセンブリ1-5、の協調活性化を介して動作している可能性を支持している。機能モジュール性にも依存すると脳回路6,7の構造的なモジュラー組織に関連付けられている。どの機能と脳回路の構成は相互に形状がまだ神経科学の主要な未解決の問題の一つである。この問題のより深い理解を提供するために、それは対処することが可能であり、少なくとも部分的に、これらの問題に最適な実験的なフレームワークを同定することが重要である。 in vivo実験で神経回路網の時空間的動態の制御された操作が困難であるので、 インビトロでの神経回路網モデルの開発は、その容易なaccのに重要な関心事であるessibility、監視、操作とモデリング8,9。近年では、高度な基板のパターニング方法でサポートされているインビトロの技術は、事前定義されたモジュラー構造体3の範囲を開発するために、神経細胞のネットワークを誘導し、課せられたトポロジ10とのネットワークの機能的特性を研究することができました。特に、本 発明の方法は、最近、物理的な制約を課すことにより4,11ネットワークを編成するために使用された。実際に、神経回路網における構造と機能との間のリンクを研究し、ニューロンアセンブリを相互作用の簡略化したが、妥当な表現を提供するために、in vitro系は、相互接続された神経細胞の亜集団を提供するべきである。広く研究されている2D均質なニューロン培養は、回路の自己組織創発配線上の任意の空間的な制約を課さない。そのため人工的に相互接続された電池アセンブリを形成するための可能なアプローチは、スパッツの異なるニューロン集団を配置することであるially異なる領域。これらの領域間の距離は、インターアセンブリの接続を防ぐことはできません。このアプローチは、ネットワークの複雑性を超えるかなりの制御を確保しつつ、同期モデル6,7,12の豊かなレパートリーを提供することが示されている。
モジュラー神経アセンブリの再現性の培養を容易にするために、軸索および樹状突起によって連結されたニューロンのクラスタにネットワークの自己組織化を組み立てるためのプロトコルを提示し、説明する。神経細胞培養の物理的閉じ込めのためのポリマー構造がpolydimtheylsiloxane(PDMS)から作成されました。 PDMSは広くガス13に、その生体適合性、透明性及び透過性のために、生物医学的用途に使用されるエラストマーである。 PDMSをスピンコートジャックらに以前に記載されている「マスター」に液体PDMSを16 Tによって2075 14,15の構造を作製し、マイクロマシンSU8から除外される彼は、異なるサイズの相互接続されたモジュールで構成され、それらが成功したカバーガラスと微小電極アレイ(MEAの)17-20の両方で得られたパターン化された神経回路網を達成しました。モジュール間の接続の密度は、モジュール間の同期の過渡状態に、均一な培養の典型的な、完全に同期化ネットワークから、ネットワーク同期の機能を変更することができます。
機能的に相互接続された回路からなる、in vitroでの2Dモジュラー神経ネットワークを成長させるためのプロトコルについて説明する。手順は、細胞の接着層をパターニングに基づいています。パターニングは、所望のネットワーク·アーキテクチャの負の特徴を再現するPDMSのステンシルを用いて達成される。 PDMSのステンシルは、細胞接着層が堆積される領域を定義する。細胞がメ?…
The authors have nothing to disclose.
この作品は、欧州プロジェクトBRIANBOW(FP7-ヤング探検家によってサポートされていました、著者は、ビデオで使用されるグラフィックスの生産に彼女の助けのための原稿上の有益なコメント博士ヤコポTessadori、そしてシルビアChiappaloneに感謝したいと思います。
PDMS, Sylgard 184 | Dow Corning | ||
Nalgene Vacuum Chamber | Thermo | 5305-0609 | |
Poly-D-Lysine PDL | Sigma | P7886 | |
silicone grease – SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
Spin Coater | Laurell – Technologies Corporation | WS-650-23 | |
12 well culture plate | Sigma | CLS3336 | |
5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma | F0503 | |
Uridine | Sigma | U3003 | |
silicone grease – SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
TC02 | Multi Channel Systems | ||
Pen Strep | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1c | |
B-27 | Gibco | 17504044 | |
glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
MEM Minimum Essential Medium-Eagle | Biological Industries Beit Haemek | 01-025-1B | |
Micro Electrode Arrays 4Q | Multi Channel Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr | cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com |
silicon wafer | microchem | SU8-2075 | Preparation protocol: www.microchem.com |