Design, Overfladebehandling, Cellular Plating, og Dyrkning af Modular Neuronal Networks Sammensat for Funktionelt Inter-tilsluttede strømkredse
Summary
Dette håndskrift beskriver en protokol til at vokse in vitro modulære netværk bestående af rumligt begrænset, funktionelt indbyrdes forbundne neuronale kredsløb. En polymer maske anvendes til at mønsteret et protein lag for at fremme cellulær adhæsion over dyrkning substrat. Belagte neuroner vokse på coatede områder oprettelse spontane forbindelser og udviser elektrofysiologisk aktivitet.
Abstract
Hjernen fungerer via den koordinerede aktivering og den dynamiske kommunikation af neuronforsamlinger. En større åbent spørgsmål er, hvordan et stort repertoire af dynamiske motiver, der ligger til grund mest forskelligartede hjernefunktioner kan opstå ud af en fast topologisk og modulær organisering af hjernens kredsløb. Sammenlignet med in vivo undersøgelser af neuronale kredsløb, som udgør iboende eksperimentelle vanskeligheder in vitro præparater tilbyder en langt større mulighed for at manipulere og sonde de strukturelle, dynamiske og kemiske egenskaber af eksperimentelle neuronale systemer. Dette arbejde beskriver en in vitro eksperimentel metode, der tillader dyrkning af modulære netværk bestående af rumligt adskilte, funktionelt sammenhængende neuronforsamlinger. Protokollen tillader styring af todimensionale (2D) arkitektur af den neuronale netværk på forskellige niveauer af topologiske kompleksitet.
En ønskede netværk mønster kan væreopnået både på almindelige dækglas og substrat indlejret mikro elektrode arrays. Mikrobearbejdet strukturer er præget på en siliciumskive og bruges til at skabe biokompatible polymere stencils, der inkorporerer de negative træk ved den ønskede netværksarkitektur. De stencils er placeret på dyrkning substrater under overfladebelægningen procedure med et molekylært lag for at fremme cellulær adhæsion. Efter fjernelse af stencils, er neuroner belagt og de spontant omdirigeret til de belagte områder. Ved at reducere den indbyrdes rum afstand, er det muligt at opnå enten isolerede eller sammenkoblede neuronale kredsløb. For at fremme celleoverlevelse celler co-dyrket med et understøttende neuronal net, der er placeret ved periferien af dyrkningsskålen. Elektrofysiologiske og optiske optagelser af aktiviteten af modulære netværk opnået henholdsvis ved hjælp af substrat indlejret mikro elektrodesæt og calcium imaging præsenteres. Mens hvert modul viser spontaneous globale synkroniseringer, er forekomsten af inter-modul synkronisering reguleret af tætheden af forbindelsen mellem kredsløb.
Introduction
Eksperimentelle og teoretiske beviser støtter muligheden for, at hjernen fungerer ved koordineret aktivering af celle samlinger 1-5, som kan betragtes som dynamiske funktionelle enheder, der forbigående interagere med hinanden, forme og underliggende forskellige hjerne stater. Funktionel modularitet er også afhængig af og forbundet med den strukturelle modulære organisering af hjernens kredsløb 6,7. Hvordan funktion og struktur hjernens kredsløb form gensidigt hinanden er stadig en af de vigtigste åbne spørgsmål i neurovidenskab. At give en dybere forståelse af dette spørgsmål, er det vigtigt at identificere optimale eksperimentelle rammer, hvor det er muligt at tage fat, i det mindste delvist, disse spørgsmål. Siden kontrolleret manipulation af spatio-tidsmæssige dynamik neuronale netværk i in vivo-forsøg er udfordrende, udvikling af in vitro-modeller neuronale netværk er af væsentlig interesse på grund af deres let accessibility, overvågning, manipulation og modellering 8,9. I de senere år har in vitro teknologier understøttes af avancerede substrat mønsterdannende metoder lov til at fremkalde neurale netværk til at udvikle en række foruddefinerede modulkonstruktioner 3 og studere de funktionelle egenskaber af netværk med pålagte topologier 10. Især blev metoder nylig bruges til at organisere netværk ved at pålægge fysiske begrænsninger 4,11. Faktisk, for at studere sammenhængen mellem struktur og funktion i neuronale netværk og give en forenklet, men plausibel repræsentation af interagerende neuronforsamlinger bør in vitro systemer giver indbyrdes forbundne neuronale delpopulationer. Vidt studeret 2D homogene neuronkulturer ikke pålægger rumlige begrænsninger på selvorganiseret emergent ledningsføring af kredsløbene. Derfor er en mulig tilgang til at forme kunstigt forbundne celle forsamlinger er at positionere forskellige neuronale populationer i spyttedeially adskilte områder. Afstanden mellem disse områder er ikke til hinder inter forsamlinger tilslutninger. Denne tilgang, samtidig med at en betydelig kontrol over netværk kompleksitet, har vist sig at give en rigere repertoire af synkronisering modeller 6,7,12.
For at lette en reproducerbar dyrkning af modulære neuronforsamlinger, at en protokol samle selvorganisering af netværk i neuronale klynger forbundet af axoner og dendritter præsenteres og beskrives. Den polymere struktur for fysisk indeslutning af neuronale kulturer er blevet skabt fra polydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS er en elastomer vid udstrækning anvendes til biomedicinske anvendelser på grund af sin biokompatibilitet, gennemsigtighed og permeabilitet for gasser 13. PDMS fremstilles og udelukket fra mikrobearbejdet SU8 2075 14,15 strukturer ved spin-coating af en flydende PDMS på en "master" som beskrevet tidligere i Jackman et al. 16 THan opnåede mønstrede neuronale netværk er sammensat af indbyrdes forbundne moduler af forskellig størrelse, og de er med held blevet opnået på begge dækglas og Micro Elektrode Arrays (MEA) 17-20. Tætheden af forbindelser mellem modulerne kan ændre funktioner af netværket synkronisering fra en fuldt synkroniseret netværk, typisk af ensartede kulturer, til forbigående tilstande af synkronisering mellem moduler.
Protocol
Representative Results
Discussion
En protokol til at vokse 2D modulære neuronale netværk in vitro består af funktionelt indbyrdes forbundne kredsløb beskrives. Proceduren er baseret på mønstring et cellulært klæbelag. Mønsterdannelse opnås med PDMS stencils gengive negative træk ved den ønskede netværksarkitektur. PDMS stencils definerer de områder, hvor det cellulære klæbelag deponeres. Når cellerne er belagt, de spontant samle de coatede øer og selv-organisere til aktive indbyrdes forbundne kredsløb. Optagelser af funktione…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af det europæiske projekt BRIANBOW (FP7- Young Explorers vil Forfatterne takker Dr. Jacopo Tessadori til nyttige kommentarer til manuskriptet, og Silvia Chiappalone for hendes hjælp i produktion af grafik, der anvendes i videoen.
Materials
| PDMS, Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| Nalgene Vacuum Chamber | Thermo | 5305-0609 | |
| Poly-D-Lysine PDL | Sigma | P7886 | |
| silicone grease – SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| Spin Coater | Laurell – Technologies Corporation | WS-650-23 | |
| 12 well culture plate | Sigma | CLS3336 | |
| 5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| silicone grease – SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
| TC02 | Multi Channel Systems | ||
| Pen Strep | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1c | |
| B-27 | Gibco | 17504044 | |
| glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| MEM Minimum Essential Medium-Eagle | Biological Industries Beit Haemek | 01-025-1B | |
| Micro Electrode Arrays 4Q | Multi Channel Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr | cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com |
| silicon wafer | microchem | SU8-2075 | Preparation protocol: www.microchem.com |
References
- Buzsaki, G. Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68, 362-385 (2010).
- Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. Modular and hierarchically modular organization of brain networks. Frontiers in Neuroscience. 4, 200 (2010).
- Levy, O., Ziv, N. E., Marom, S. Enhancement of neural representation capacity by modular architecture in networks of cortical neurons. European Journal of Neuroscience. 35, 1753-1760 (2012).
- Berdondini, L., et al. A microelectrode array (MEA) integrated with clustering structures for investigating in vitro neurodynamics in confined interconnected sub-populations of neurons. Sensors and Actuators B-Chemical. 114, 530-541 (2006).
- Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PloS One. 9, e107400 (2014).
- Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Innate synchronous oscillations in freely-organized small neuronal circuits. PloS One. 5, e14443 (2010).
- Shein-Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Engineered neuronal circuits: a new platform for studying the role of modular topology. Frontiers in Neuroengineering. 4, 10 (2011).
- Bonifazi, P., et al. In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses. Front Neural Circuits. 7, 40 (2013).
- Jungblut, M., Knoll, W., Thielemann, C., Pottek, M. Triangular neuronal networks on microelectrode arrays: an approach to improve the properties of low-density networks for extracellular recording. Biomedical Microdevices. 11, 1269-1278 (2009).
- Marconi, E., et al. Emergent functional properties of neuronal networks with controlled topology. PloS One. 7, e34648 (2012).
- Taylor, A. M., Jeon, N. L. Microfluidic and compartmentalized platforms for neurobiological research. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39, 185-200 (2011).
- Sorkin, R., et al. Compact self-wiring in cultured neural networks. J Neural Eng. 3, 95-101 (2006).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical micro/nanosystems. Biomedical Microdevices. 7, 281-293 (2005).
- Campo, A. G. C. SU-8: a photoresist for high-aspect-ratio and 3D submicron lithography. Journal of Micromechanics and MicroengineeringEmail alert RSS feed. 17, 81-95 (2007).
- Liu, G. T. Y. Kan Y Fabrication of high-aspect-ratio microstructures using SU8 photoresist. Microsystem Technologies. 11, 343-346 (2005).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15, 2973-2984 (1999).
- Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 2, 19-31 (1980).
- Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. New Fixed-Array Multi-Microelectrode System Designed for Long-Term Monitoring of Extracellular Single Unit Neuronal-Activity In vitro. Neuroscience Letters. 6, 101-105 (1977).
- Gross, G. W., Williams, A. N., Lucas, J. H. Recording of spontaneous activity with photoetched microelectrode surfaces from mouse spinal neurons in culture. Journal of Neuroscience Methods. 5, 13-22 (1982).
- Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74, 61-66 (1972).
- Herzog, N., Shein-Idelson, M., Hanein, Y. Optical validation of in vitro extra-cellular neuronal recordings. J Neural Eng. 8, 056008 (2011).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177, 241-249 (2009).
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab Chip. 9, 404-410 (2009).
- Georger, J. H., et al. Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth. Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).
- Torimitsu, K., Kawana, A. Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture. Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).
- Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks. Medical & Biological Engineering & Computing. 36, 135-141 (1998).
- Petrelli, A., et al. Nano-volume drop patterning for rapid on-chip neuronal connect-ability assays. Lab on a Chip. 13, 4419-4429 (2013).
- Boehler, M. D., Leondopulos, S. S., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Hippocampal networks on reliable patterned substrates. Journal of Neuroscience Methods. 203, 344-353 (2012).
