Novel Rasterkraftmikroskopie.Wie Biopanning für Isolierung von Morphologie Spezifische Reagenzien gegen TDP-43 Varianten in Amyotrophe Lateralsklerose

Summary

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Abstract

Weil Protein-Varianten spielen kritische Rollen bei vielen Erkrankungen einschließlich TDP-43 in Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), alpha-Synuclein in der Parkinson-Krankheit und beta-Amyloid und Tau in Alzheimer-Krankheit, ist es von entscheidender Bedeutung, um die Morphologie spezifische Reagenzien, die selektiv entwickeln kann Diese krankheitsspezifische Proteinvarianten, die Rolle dieser Varianten in Krankheitspathologie und für mögliche diagnostische und therapeutische Anwendungen zu untersuchen. Wir haben neue Rasterkraftmikroskopie (AFM), basierend Biopanning Techniken, die Isolierung von Reagentien, die selektiv erkennen krankheitsspezifische Proteinvarianten können entwickelt. Es gibt zwei wichtige Phasen in den Prozess, den negativen und positiven Panning Phasen beteiligt. Während der negativen Panning Phase werden Phagen, die Off-Target-Antigenen reaktiv sind, durch mehrere Runden der subtraktiven Panning unter Verwendung einer Reihe von sorgfältig ausgewählten off-Zielantigene eliminiert. Ein wesentliches Merkmal in der negativenPanning Phase nutzt AFM, um den Prozess zu überwachen und zu bestätigen, dass alle unerwünschten Phagen Partikel entfernt sind. Für die positive Panning Phase wird das Zielantigen von Interesse auf einer Glimmer-Oberfläche fixiert und gebundenen Phagen werden eluiert und gesiebt, um Phagen, die selektiv das Zielantigen binden identifizieren. Die Zielproteinvariante muss nicht gereinigt werden, sofern die entsprechenden negativen Panning Kontrollen verwendet wurden. Auch Zielproteinvarianten, die nur in sehr niedrigen Konzentrationen in komplexen biologischen Materials in der positiven Panning Schritt verwendet werden vorliegen. Durch Anwendung dieser Technologie übernahmen wir Antikörper gegen Proteinvarianten der TDP-43, die selektiv in menschlichen ALS Hirngewebe gefunden werden. Wir erwarten, dass dieses Protokoll anwendbar sein sollte, um die Erzeugung Reagentien, die selektiv binden Proteinvarianten in einer Vielzahl von verschiedenen biologischen Prozessen und Krankheiten vorkommen.

Introduction

Die Anwesenheit von Protein-Varianten wurde als ein Faktor beim Fortschreiten vieler Krankheiten, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson, ALS und frontotemporale Demenz (FTD) ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9} verwickelt ^{, 10,11.} Oligomere Formen der Proteine ​​beta-Amyloid und alpha-Synuclein sind gedacht, um die toxischen Spezies von Alzheimer und Parkinson, jeweils ^2,3,4,5 verantwortlich. Aggregate der TAR DNA-bindende Protein 43 (TDP-43) wurden an ALS und FTD ^12,13,14 verbunden. Daher Reagenzien wie Antikörpern, die selektiv die verschiedenen Proteinvarianten können leistungsfähige Werkzeuge, um als diagnostische Marker und potenziellen Therapeutika dienen können. In dieser Studie haben wir uns auf die Entwicklung von Reagenzien, die selektiv binden Varianten des TDP-43-Proteins in ALS verwickelt, aber die Technik, die in diesem Dokument beschriebenen sollte für die Isolierung von Reagenzien werden gegenüber einer Vielzahl von protEin Varianten.

Zytoplasmatische Aggregation von TDP-43 wurde als pathologisches Merkmal bei ALS ^{15,16,17,18,19} identifiziert. Typischerweise TDP-43 ist im Kern von allen Zellen, die von einem normalen Individuum gefunden werden, obwohl es zwischen Cytosol und Nukleus ^15,17 bewegen tendiert. Bei ALS aggregierten Formen von TDP-43 sind im Zytoplasma der ausgewählten Neuronen und Glia mit geringeren Konzentrationen in den Zellkern was auf die Bewegung des TDP-43 aus dem Zellkern in das Cytoplasma bei der Krankheitsprogression ^16,20 gefunden detektiert. Während Aggregation von TDP-43 ist in den meisten Fällen gefunden, ALS, ist es nicht in allen Fällen, da 1% bis 2% der gesamten ALS Fälle (oder 15% -20% der familiären ALS Fälle) werden, um Mutationen in die verknüpfte Konto Superoxid-Dismutase 1 (SOD1) Gen ^15,17. Wegen der wichtigen Rolle der TDP-43 in der überwiegenden Mehrheit der Fälle ALS, hier konzentrieren wir uns auf die Entwicklung von Antikörper-basierten Reagenzien, die selektiv an TDP-43-Varianten, die sich binden könnenin der menschlichen Nutzung unserer neuartigen AFM basierend Biopanning Techniken ALS Hirngewebe vorhanden.

Zunächst brauchen wir ein breites Repertoire von Antikörper-Bindungsdomänen. Wir kombinierten drei verschiedenen Phagen-Display-single chain variable Domäne Antikörperfragment (scFv) Bibliotheken (Tomlinson I und J und Blätter Bibliotheken ^21). Die Panning Prozess ist in negative und positive Panning Phasen unterteilt. Phagen aus den Bibliotheken werden zuerst mit der negativen Panning während welcher Phagen reaktiv mehreren Off-Target-Antigene ausgeschlossen unterworfen. Nach dem Abschluss jeder Runde der negativen Panning gegen jede Off-Target-Antigen wird der Prozess durch AFM überwacht, um sicherzustellen, dass alle Phagenbindung die Off-Target-Antigene wurden entfernt. Erst nach Überprüfung durch AFM, die alle reaktiven Phagen entfernt werden wir gehen in die nächste Ziel. Um Reagenzien gegen TDP-43-Varianten bei ALS beteiligt isolieren wir benutzt die folgenden negativen Panning-Antigene: 1) BSA, um Phagen, die schwach oder nicht-spezifisch an Proteine ​​binden, zu entfernen; 2) aggregierte Alpha-Synuclein, um Phagen, die generische Strukturelemente der aggregierten Proteine ​​binden zu entfernen; 3) menschliche Gehirn Gewebehomogenaten auf Phagen, die auf alle Proteine ​​oder andere in Post-mortem-Proben von gesunden menschlichen Hirngewebe vorhandenen Komponenten zu binden, zu entfernen; 4) immun TDP-43 von gesunden menschlichen Gehirn auf Phagen, die für alle TDP-43 bildet mit gesunden menschlichen Gehirn assoziiert binden zu entfernen; und 5) immunpräzipitiert TDP-43 isoliert von FTD Hirnhomogenaten auf Phagen, die TDP-43-Varianten mit nicht-ALS-Pathologie assoziiert binden zu entfernen. Nach Entfernung aller Phagen an alle Off-Target-Antigenen reaktiv sind, schließlich wurden die positive Schwenkphase, in der Antikörperfragmenten, die das Antigen von Interesse binden, isoliert werden, in diesem Fall TDP-43 von menschlichem ALS Hirngewebe immunpräzipitiert. Diese isolierten Antikörper können aggregiert oder modifizierte Formen von TDP-43 reagieren.

"> Konventionelle Phagen Biopanning konzentriert sich vor allem auf die positive Phase ^22,23 Panning. Gewöhnlich wird die interessierende Target immobilisiert ist, die Phagen-Bibliothek hinzugefügt und gebundene Phagen eluiert. Die Phagen werden dann verstärkt und in die Richt erneut. Diese Verstärkung und Inkubationsprozesses wird üblicherweise mehrmals wiederholt, um den Prozentsatz an positiven bindenden Phagen zu erhöhen. Obwohl Variationen dieser Verfahren sind weitgehend verwendet worden, um Antikörper-Reagenzien gegen ein breites Spektrum von Zielantigene zu isolieren, sie erfordert in der Regel große Mengen an gereinigtem Zielantigen ^{24,25,26, 27,} wohingegen unsere Verfahren erfordert nur Spuren der Ziel-Antigen ist. Die hier beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um Reagenzien, die selektiv an Zielantigenen, die in sehr geringen Konzentrationen vorhanden sind, ohne die Notwendigkeit für die Reinigung und den Schwenk direkt gegen erfolgen isolieren in komplexe Gewebeproben vorhandenen Antigen. Die Verwendung von erschöpfenden negativen Panning-Protokolle verifiziertAFM sorgt dafür, dass Klone gegen die positive Antigen isoliert sollten selektiv das Ziel binden, auch wenn sie nicht gereinigt oder angereichert.

Kasturirangan und Mitarbeiter (2003) haben eine ähnliche negative und positive Biopanning Verfahren, um Antikörper zu oligomeren beta-Amyloid mit Nanogramm-Konzentration des Target ⁵ reaktive isolieren geführt. Hier an diesem Verfahren zu erweitern, um die Erzeugung von Reagenzien, die selektiv binden krankheitsspezifische Proteinvarianten direkt aus menschlichen Gewebeproben zu ermöglichen. In zukünftigen Studien wollen wir weiter untersuchen nicht nur den diagnostischen Wert der Reagenzien hier isoliert, sondern auch prüfen, ihre therapeutische Bedeutung für die Behandlung von ALS.

Insgesamt sollte unserer neuartigen AFM basiert Biopanning-Technologie für die Isolierung irgendkrankheitsspezifische Proteinvariante in jedes biologische Material sein, ohne die Notwendigkeit für die Proteinreinigung oder Änderung, auch wenn das Ziel-Antigen concentrations sind extrem niedrig.

Protocol

1. Phagenproduktion Führen Sie alle Phagenproduktion und Biopanning Prozessen in einem biologischen Sicherheitsschrank. Produzieren Phagen Partikel aus den verschiedenen Bibliotheken (Tomlinson I und J Bibliotheken und Blätter Bibliothek 21) für das Biopanning Prozess mit den Anweisungen des Herstellers (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf). BEMERKUNG: Wir verwenden mehrere Bibliotheken in unserer Panning, um die Vielfalt der zur Verfügung stehenden …

Representative Results

In Abbildung 1 ist die schematische zeigt die negativen Panning von denen wir entfernt Phagenbindung off-Zielantigene aus der Bibliothek unter Verwendung von Immunoröhrchen. Wir haben zunächst mit BSA begonnen, da dies ein gemeinsames Blockmittel und jeder Phage, unspezifisch reagieren mit dieser Ziel problematisch wäre in Zukunft Immunoassays. Als nächstes wir entfernt Bindemittel aggregierte alpha-Synuclein Phagen mit generischen Strukturen der aggregierten Proteine ​​(dh, ein Antikö…

Discussion

Protein variants have been shown to be involved in the progression of many neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s, Parkinson’s, ALS and FTD^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11}. Isolation of antibodies that can selectively recognize these different protein variant targets can be effective reagents to study, diagnose and potentially treat such ailments. To generate such variant specific antibodies we have developed a novel biopanning process that utilizes atomic force microscopy to monitor the progress …

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Tomlinson I and J Libraries	MRC (Cambridge, England)
Sheets Library	MRC (Cambridge, England)
2xYT	BD Sciences	244020
Glucose	Amresco	0188-2.5KG
Ampicillin	Amresco	0339-25G	Irritant
KM13 Helper Phage	MRC (Cambridge, England)
Kanamycin	OmniPur	5880	Irritant
Polyethylene Glycol 8000	OmniPur	6510	Irritant
Sodium Chloride	Macron	7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic	Amresco	0404-1KG	Irritant
Potassium Chloride	EMD	PX1405-1	Irritant
Potassium Phosphate Monobasic	Amresco	0781-500G	Irritant
TG1 Cells	MRC (Cambridge, England)
Luria-Bertani Agar	EMD	1.10283.0500
Bovine Serum Albumin	Amresco	0332-100G
STEN buffer	Crystalgen Inc.	33429775
Immunotubes	Thermo Scientific	470319
Mica	Spruce Pine Mica	24365
Tween 20	EMD
Trypsin	Sigma	T-0303	Irritant
Triethylamine	Sigma	T-0886	Flammable
Glycerol	Amresco	0854-1L	Irritant
DNA Plasmid Prep Kit	qiagen	27106	Irritant
Non-Fat Milk Powder	Carnation
96-Well High Binding ELISA Plate	Costar	3590
Anti-M13 HRP	GE Healthcare Life Sciences	27-9421-01
ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit	Thermo Scientific	37074
Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody	ProteinTech	10782-2-AP
A/G Agarose Beads	Santa Cruz Biotechnology	sc-2003
HB 2151 Cells	MRC (Cambridge, England)
Isopropylthiogalactoside	Teknova	13325
9e10 HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-40
Nitrocellulose Membrane	Biorad	162-0115	Flammable
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall RC 6+
Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope	Veeco
AFM Probes	VistaProbes	T300R-10