Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticelle per applicazioni di imaging multimodale molecolari
Summary
This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.
Abstract
Multimodale, imaging molecolare permette la visualizzazione dei processi biologici a risoluzioni cellulare, subcellulare, e a livello molecolare che utilizzano più tecniche di imaging complementari,. Questi agenti di imaging facilitano la valutazione in tempo reale dei percorsi e meccanismi in vivo, che migliorano sia efficacia diagnostica e terapeutica. Questo articolo presenta il protocollo per la sintesi di nanoparticelle biofunctionalized Prussia blu (PB NP) – una nuova classe di agenti per l'uso in applicazioni di imaging multimodali, molecolare. Le modalità di imaging incorporati nel nanoparticelle, imaging di fluorescenza e la risonanza magnetica (MRI), hanno caratteristiche complementari. Le PB NP possiedono un design core-shell in cui gadolinio e ioni manganese incorporati negli spazi interstiziali del reticolo PB generano MRI contrasto, sia in T 1 e T 2 pesate sequenze. Le PB NP sono rivestiti con avidina fluorescente utilizzando elettrostatico auto-astaggio, che permette l'imaging di fluorescenza. Le nanoparticelle avidina rivestite vengono modificati con leganti biotinilati che conferiscono capacità di targeting molecolare ai nanoparticelle. La stabilità e la tossicità delle nanoparticelle sono misurati, così come i loro relassività MRI. I multimodali, capacità di imaging molecolare di questi biofunctionalized PB NP sono poi dimostrate utilizzandoli per imaging di fluorescenza e MRI molecolare in vitro.
Introduction
L'imaging molecolare è la visualizzazione non invasiva e mirata dei processi biologici a livello cellulare, subcellulare e livello molecolare 1. L'imaging molecolare permette un esemplare di rimanere nel suo microambiente nativa mentre i percorsi ei meccanismi endogeni sono valutati in tempo reale. Tipicamente, imaging molecolare prevede la somministrazione di un agente di imaging esogeno sotto forma di una piccola molecola, macromolecola, o nanoparticelle di visualizzare, destinazione, e tracciare processi fisiologici relativi allo studio 2. Le varie modalità di imaging che sono state esplorate in imaging molecolare includono MRI, CT, PET, SPECT, ultrasuoni, fotoacustica, spettroscopia Raman, bioluminescenza, fluorescenza e microscopia intravitale 3. Imaging multimodale è la combinazione di due o più modalità di imaging in cui la combinazione migliora la capacità di visualizzare e caratterizzare vari processi e 4 eventi biologici. Multimodal di imaging sfrutta i punti di forza delle singole tecniche di imaging, mentre compensando i loro limiti individuali 3.
Questo articolo presenta il protocollo per la sintesi di nanoparticelle biofunctionalized Prussia blu (PB NP) – una nuova classe di agenti di imaging multimodali, molecolare. Le PB PN sono utilizzati per imaging di fluorescenza e la risonanza magnetica molecolare. PB è un pigmento costituito da un alternarsi di ferro (II) e ferro (III) atomi in un reticolo cubico a facce centrate (Figura 1). Il reticolo PB comprende ligandi cianuro lineari in un Fe II – CN – Fe III linkage che incorpora cationi per bilanciare oneri all'interno della rete tridimensionale 5. La capacità di PB di incorporare cationi nel suo reticolo viene sfruttata caricando separatamente gadolinio e gli ioni di manganese nelle PN PB per MRI contrasto.
Il razionale per perseguire un progetto di nanoparticelle per MRI contrasto è a causa dii vantaggi questo disegno offre rispetto a mezzi di contrasto MRI attuali. La stragrande maggioranza degli agenti di contrasto MRI US FDA ha approvato sono chelati di gadolinio che sono paramagnetica in natura e forniscono contrasto positivo dal meccanismo relax 6,7,8 spin-reticolo. Rispetto ad un singolo gadolinio chelato che fornisce bassa intensità di segnale propria, l'incorporazione di molteplici ioni gadolinio all'interno del reticolo PB delle nanoparticelle fornisce una maggiore intensità di segnale (contrasto positivo) 3,9. Inoltre, la presenza di più ioni gadolinio all'interno del reticolo PB aumenta la densità di spin complessiva e la grandezza paramagnetismo delle nanoparticelle, che disturba il campo magnetico locale nelle sue vicinanze, generando contrasto negativo dal meccanismo di rilassamento spin-spin. Così le nanoparticelle contenenti gadolinio funzionano sia come T 1 (positivo) e T 2 agenti (negativo) contrasto 10,11.
In un sottogruppo di pazienti con funzione renale compromessa, la somministrazione di mezzi di contrasto a base di gadolinio è stato collegato allo sviluppo di fibrosi sistemica nefrogenica 8,12, 13. Questa osservazione ha spinto indagini l'uso di ioni paramagnetici alternativi come agenti di contrasto per MRI. Pertanto, il design versatile delle nanoparticelle è adattato per incorporare ioni manganese all'interno del reticolo PB. Simile al gadolinio-chelati, manganese chelati sono anche paramagnetica e sono tipicamente utilizzati per fornire intensità del segnale positivo in MRI 7,14. Come con gadolinio contenenti PB PN, i-manganese contenenti PB NP funzionano anche come T 1 (positivo) e T 2 agenti (negativo) di contrasto.
Per incorporare funzionalità di imaging di fluorescenza, le nanoparticelle "core" sono rivestite con un guscio "biofunzionale" costituito dalla avidina fluorescenza marcata glicoproteina (Figura 1). Avidina consente non solo di imaging di fluorescenza, ma serve anche come piattaforma di attracco per ligandi biotinilati che colpiscono le cellule e tessuti specifici. Il legame avidina-biotina è uno dei più forti legami noti, non covalenti caratterizzati da estremamente forte affinità di legame tra avidina e biotina 15. L'attaccamento di ligandi biotinilati al avidina rivestite PB NP conferisce capacità di targeting molecolare ai NP PB.
La motivazione per il perseguimento di fluorescenza e RM con PB NP è perché queste modalità di imaging possiedono caratteristiche complementari. Imaging di fluorescenza è una delle tecniche di imaging molecolare ottici più diffusi, e consente la visualizzazione simultanea di più oggetti ad alte sensibilità 1,16,17. Imaging di fluorescenza è una cassetta di sicurezza, modalità non invasiva, ma è associato a basse profondità di penetrazione e risoluzioni spaziali 1,3,16. D'altra parte, un MRI genera alta temporaled risoluzione spaziale in modo non invasivo e senza la necessità di radiazioni ionizzanti 1,3,16. Tuttavia MRI soffre di bassa sensibilità. Pertanto imaging di fluorescenza e la risonanza magnetica sono stati selezionati come le tecniche di imaging molecolare per le loro caratteristiche complementari di penetrazione di profondità, sensibilità e risoluzione spaziale.
Questo articolo presenta il protocollo per la sintesi e biofunzionalizzazione delle NP PB, contenente gadolinio PB NP (GdPB), e contenente manganese PB NP (MnPB) 10,11. I seguenti metodi sono descritti: 1) la misura di dimensioni, carica, e la stabilità temporale delle nanoparticelle, 2) valutazione della citotossicità delle nanoparticelle, 3) di misura della relassività MRI, e 4) utilizzazione delle nanoparticelle per fluorescenza e RM molecolare di una popolazione di cellule bersaglio in vitro. Questi risultati dimostrano il potenziale delle NP per l'uso come agenti di imaging multimodali, molecolari in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo ha presentato i metodi per la sintesi di una nuova classe di agenti di imaging multimodali, molecolari basati su biofunctionalized Prussia nanoparticelle blu. Le modalità di imaging molecolare incorporati nelle nanoparticelle sono imaging di fluorescenza e la risonanza magnetica molecolare, a causa delle loro caratteristiche complementari. Le nanoparticelle di Prussia blu biofunctionalized hanno un design core-shell. I passaggi chiave nella sintesi di queste nanoparticelle sono: 1) one-pot sintesi che p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation (RAC Awards #30000174 and 30001489).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6 · 3H2O) | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2 · 4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3 · 6H2O) | Sigma-Aldrich | 211591 | |
| Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3 · 6H2O) | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate Antibody | Millipore | AB5320 | |
| Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3 | Peprotech | 500-P156GBT | |
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| BSG D10 Cell Line | Lab stock | — | |
| OE21 Cell Line | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| SUDIPG1 Neurospheres | Lab stock | — | |
| Eol-1 Cell Line | Sigma-Aldrich | 94042252 | |
| Poly(L-lysine) hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1399 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Aminoactinomycin D | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange, AM | Life Technologies | C34851 | |
| Avidin-Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21370 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Peristaltic Pump | Instech | P270 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | |
| Sonicator | QSonica | Q125 | |
| Hot Plate/Magnetic Stirrer | VWR | 97042-642 | |
| Ultra Clean Aluminum Foil | VWR | 89107-732 | |
| Vortex Mixer | VWR | 58816-121 | |
| 1.7 mL conical microcentrifuge tubes | VWR | 87003-295 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | VWR | 21008-918 | |
| Tube holders | VWR | 82024-342 | |
| Disposable plastic cuvettes | VWR | 7000-590 (/586) | |
| Zetasizer capillary cell | VWR | DTS1070 | |
| Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin column | VWR | 82031-356 | |
| 96-well cell culture tray | VWR | 29442-056 | |
| Trypsin EDTA 0.25% solution 1X | JR Scientific | 82702 | |
| Cell Culture Grade PBS (1X) | Life Technologies | 10010023 | |
| XTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4891-025-K | |
| T75 Flask | 89092-700 | VWR | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowhitaker | 12-604Q | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-010 | |
| Pen-Strep 1X | Life Technologies | 15070063 | |
| Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1200 | |
| Chambered Microscope Slides | Thermo Scientific | 154534 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| RPMI | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| 3 T Clinical MRI Magnet | GE Healthcare | ||
| 100 mL round-bottom flask |
References
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