Mammosphere Dannelse Assay fra human brystkræft væv og cellelinier

Summary

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Abstract

Svarende til raske væv, mange blod og faste maligniteter nu menes at være organiseret hierarkisk, med en delmængde af stamceller-lignende kræftceller, selv forny og samtidig give anledning til mere differentieret afkom. Forståelse og målretning af disse kræft stamceller i brystkræft, hvilket kan har forbedret kemo- og radio-resistens i forhold til de ikke-stammen tumor bulk, er blevet et vigtigt forskningsområde. Markører, herunder CD44, CD24, og ALDH aktivitet kan vurderes ved anvendelse af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) for fremadrettet isolere celler, der udviser forøget tumorgenicitet når implanteret i immunkompromitterede mus: den mammosphere assay er også blevet almindeligt anvendt til dets evne til efterfølgende at identificere sphere- dannende celler, der udvikler fra enkelt stamcelle-lignende kloner. Her skitsere metoder til hensigtsmæssig dyrkning af mammospheres fra cellelinjer eller primære patientprøver, deres passage og beregnede skøn sfære forming effektivitet (LSU). Først skal vi diskutere centrale overvejelser og faldgruber i den relevante planlægning og tolkning af mammosphere eksperimenter.

Introduction

Eksistensen af ​​tumor celleslægter ledet af stamceller-lignende cancer stamceller har i høj grad tilføjet til vores forståelse af tumor heterogenitet. Mens nogle fænotypiske diversitet i tumorer er en følge af den klonal udvækst af genetisk forskellige kloner, vises en væsentlig komponent at skyldes epigenetiske forskelle: kræftceller kan skifte (undertiden reversibelt) mellem stængel, stamfader, og differentierede tilstande via aktivering eller undertrykkelse af specifikt gen udtryk programmer ^{1 – 3.} Dette kan afspejle celle indre eller ydre faktorer, der afspejler genekspression program, der aktuelt udtrykkes i en celle med dens resulterende autokrint signalering sammen med parakrin signalering fra nabolandet kræft, stromale eller immunceller leverer modulerende faktorer, og microenviromental forhold som graden af hypoxi ^2,4,5.

Selv innovative afstamning sporing tilgangeer fremme vores evne til at studere formodede cancer stamceller i deres in vivo niche ^6-8, forbliver sfære-dannende assays en populær og praktisk tilgang til at estimere brystkræftceller potentiale at opføre sig som stamceller, i det mindste under assaybetingelserne anvendte. Det er ofte bruges sammen med tilbagevirkende kraft fremgangsmåder til oprensning cancer stamceller ved deres ekspression af membran markører CD44 og CD24 ⁹ og aktivitetsniveauer af enzymet ALDH (aldehyddehydrogenase) ^10, markører, der er blevet foreslået til at svare til mere mesenchymal- og epithelial -lignende cancer stamceller henholdsvis ^11. Kuglen dannelse fremgangsmåde blev først udviklet som neurosfæren assay, muliggør vækst af formodede stamceller fra enkelte kloner i ikke-adhærente, serumfri betingelser med tilsætning af epitelial vækstfaktor (EGF) ^12, senere bliver fordel anvendes til normal og kræft brystvæv.

<p class = "jove_content"> Identiteten af ​​kuglen-dannende grundlægger celle, og de blandede celletyper, der udgør sfære masse, er relevante for de konsekvenser, der kan gøres fra mammo- eller anden-sfære dannende assays. Langsigtede hvilende knogle fide stamceller, menes at hvile i G0 fase, vil ikke opleve den præcise kombination af faktorer, der favoriserer aktivering in vivo. Den mammosphere analysen i stedet muliggør væksten af celler enten klar til mitotiske deling eller allerede dividere ^13. Disse progenitorer, men ikke en virkelig hvilende celle kan være cellen fase, prolifererer med mitogener EGF og basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF), der anvendes i assayet. Ikke desto mindre indeholder en række aktiverede stamcelle-associerede signalveje ^14. Desuden hastigheden for deres dannelse angår tumorigeniciteten af det væv, de blev taget fra, når den måles ved deres potens i begrænset fortynding assays i muse-xenotransplantater ^{2,15,16 <}/ Sup>.

Her giver vi detaljerede protokoller til at isolere enkelte celler og generere primære mammospheres fra både humane brystcancercellelinier og kliniske prøver af brystkræft. Vi beskriver også, hvordan du udfører serielle passager af primære mammospheres at vurdere selvfornyelse, og hvordan man beregner sfære danner effektivitet der muliggør en sammenligning på tværs af forskellige seeding tætheder (se skema i figur 1).

Protocol

Procedurerne nedenfor er etisk godkendt af Imperial College, London. 1. Generering af Primære Mammospheres fra human brystcancercellelinjer BEMÆRK: Udfør følgende trin under en steril kultur hætte. Forbered Mammosphere Medier indeholdende DMEM / F12 suppleret med 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 U / ml streptomycin. Forbered komplette medier umiddelbart før brug ved tilsætning af 20 ng / ml rekombinant human epidermal vækstfaktor (EG…

Representative Results

Forskellige prøver eller dem udsættes for forskellige behandlinger kan variere i antallet af mammospheres> 40 um, der danner efter normalisering for første celler podet. Beregn mammosphere danner effektivitet (MFE) for hver behandling dyrket i tre eksemplarer. Dette muliggør forsøg med forskellige seeding densiteter skal sammenlignes. Data bedst vises på et søjlediagram, ideelt med positive og negative kontroller, og visning af standardafvigelsen over tredobbelte brønde. Konsekvent overføre adhærente celler…

Discussion

Vellykket vurdering af primære og sekundære mammospheres afhængig celler bliver forgyldt ved tilstrækkeligt lave tætheder der mammospheres form fra enkelte kloner, med minimal sfære sammenlægning. Men ved tætheder, der er for lav, kan for få mammospheres danne at skelne effekten af ​​behandlinger statistisk. Podningstæthed bør optimeres for hver cellelinje anvendes, da de kan variere meget i deres sfære danner effektivitetsgevinster (dem der udtrykker lav E-cadherin kan danne mindre stabile og kortere si…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
DMEM/F12	Lonza	CC-3151
2mM L-Glutamine	Sigma Aldrich	G8540
100U/ml Penicillin & Streptomycin	Sigma Aldrich	P4083
20ng/ml recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
20ng/ml recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)	R&D systems	233-FB-025
1x B27 supplement	Invitrogen	17504-044
Phosphate buffered saline (PBS);	Thermo Scientific	12399902
0.5% trypsin-0.2%EDTA;	Sigma Aldrich	59418C
Fetal Calf Serum	First Link UK	02-00-850
Trypan Blue	Sigma Aldrich	93595
Low attachment 6 well plates	Corning	CLS3814
Collagenase type 1A	Sigma Aldrich	C9891
Hyaluronidase	Sigma Aldrich	H3506
Sterile razor blades	Fisher Scientific	12443170
Sterile scalpel	Fisher Scientific	11758353
Sterile micro-dissecting scissors	Sigma Aldrich	S3146