Formação Mammosphere Ensaio de cancro da mama humano tecidos e linhas celulares
Summary
Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.
Abstract
Similar aos tecidos saudáveis, muitas sangue e tumores sólidos são pensados agora para ser organizados hierarquicamente, com um subconjunto de células-tronco cancerosas, como que se auto-renovar, dando origem a descendência mais diferenciada. Compreensão e segmentação destas células-tronco cancerosas no câncer de mama, que pode possuir reforçada quimio e radio-resistência em comparação com o volume do tumor não-haste, tornou-se uma importante área de pesquisa. Os marcadores, incluindo CD44, CD24, e a actividade de ALDH pode ser avaliada utilizando células activadas por fluorescência (FACS) para prospectivamente isolar células que exibem tumorigenicidade aumentada quando implantadas em ratinhos imunocomprometidos: o ensaio mammosphere também tem sido amplamente usada para a sua capacidade para identificar retrospectivamente sphere- formação de células que se desenvolvem a partir de clones de células-tronco como single. Aqui destacamos abordagens para a cultura apropriada de mammospheres de linhas celulares ou amostras primárias do paciente, sua passaging e cálculos para estimar esfera feficiência orming (SFE). Primeiro vamos discutir as principais considerações e armadilhas no planejamento e interpretação de experimentos mammosphere apropriado.
Introduction
A existência de linhagens de células tumorais chefiadas por células-tronco cancerosas-tronco como contribuiu largamente para a nossa compreensão da heterogeneidade tumor. Enquanto alguns diversidade fenotípica em tumores que surgem do crescimento clonal de clones geneticamente distintas, um componente substancial parece resultar de diferenças epigenéticas: as células cancerosas podem fazer a transição (por vezes de forma reversível) entre a haste, progenitor, e os estados diferenciados através da ativação ou repressão do gene específico programas de expressão 1-3. Isto pode reflectir factores intrínsecos ou extrínsecos de células, reflectindo a expressão do gene programa actualmente a ser expresso em uma célula com a sua sinalização a autócrino resultante em conjunto com sinalização parácrina da vizinha cancro, estromais ou células imunitárias entregar factores moduladores, e microenviromental condições tais como o grau de hipóxia 2,4,5.
Embora as abordagens rastreamento de linhagem inovadorasestão avançando a nossa capacidade de estudar as células-tronco do câncer putativos em sua in vivo nicho 6-8, ensaios de formação de esfera continuará a ser uma abordagem popular e conveniente para estimar o potencial de células de câncer de mama "para se comportar como células-tronco, pelo menos nas condições de ensaio utilizados. É frequentemente utilizado juntamente com os métodos retrospectivos para cancro de células estaminais de purificação, pela sua expressão de marcadores de membrana CD44 e CD24 9, e os níveis de enzima ALDH (aldeído desidrogenase) de actividade 10, marcadores que têm sido propostos para corresponder a mais mesenchymal- e epitelial -como células-tronco do câncer, respectivamente 11. A abordagem formação esfera foi desenvolvido pela primeira vez como o ensaio de neuroesferas, permitindo o crescimento de células estaminais putativas a partir de clones individuais em não-aderentes, condições livres de soro, com a adição de factor de crescimento epitelial (EGF) 12, sendo posteriormente aplicado utilmente ao normal e canceroso tecidos mamários.
<p class = "jove_content"> A identidade da célula fundadora formador de esfera, e os tipos de células mistas que constituem a massa esfera, são relevantes para as deduções que podem ser feitos a partir de mammo-, ou outra esfera formando-ensaios. Células-tronco a longo prazo ósseas repouso fide, pensado para descansar em fase G0, não vai experimentar a combinação precisa de fatores que favorecem a ativação in vivo. O ensaio mammosphere vez permite o crescimento de células ou pronta para divisão mitótica ou já divisórias 13. Estes progenitores, embora não uma célula verdadeiramente quiescente, pode ser a célula que prolifera fase com os agentes mitogénicos de EGF e factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) utilizados no ensaio. No entanto, eles contêm uma variedade de haste ativado sinalização associado a células vias 14. Além disso, a taxa da sua formação está relacionada com a tumorigenicidade de tecido que foram retiradas, quando medido pela sua potência para ensaios de diluição limitadas em xenoenxertos de ratinho 2,15,16 </ Sup>.Aqui nós fornecemos protocolos detalhados para isolar células individuais e que geram mammospheres primárias de ambas as linhas de células de câncer de mama humano e amostras clínicas de tumores de mama. Nós também descrevem como executar passagens em série de mammospheres primários para avaliar a auto-renovação, e como calcular esfera formando eficiência que permite a comparação entre diferentes densidades de semeadura (ver esquema na figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Avaliação positiva dos mammospheres primárias e secundárias depende das células sendo banhado pelo suficientemente baixas densidades que mammospheres formulário a partir de clones de solteiro, com esfera de agregação mínima. No entanto em densidades que são muito baixos, muito poucos mammospheres podem formar para distinguir os efeitos de tratamentos estatisticamente. Densidade de semeadura deve ser otimizado para cada linha celular utilizada, uma vez que podem variar consideravelmente em suas eficiências esf…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pela BRC imperial, o Instituto Nacional de Pesquisa em Saúde e Acção contra o Cancro, com menção especial para Hilary Craft e Sir Douglas Myers.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
| 2mM L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | |
| 100U/ml Penicillin & Streptomycin | Sigma Aldrich | P4083 | |
| 20ng/ml recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| 20ng/ml recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | R&D systems | 233-FB-025 | |
| 1x B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS); | Thermo Scientific | 12399902 | |
| 0.5% trypsin-0.2%EDTA; | Sigma Aldrich | 59418C | |
| Fetal Calf Serum | First Link UK | 02-00-850 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Low attachment 6 well plates | Corning | CLS3814 | |
| Collagenase type 1A | Sigma Aldrich | C9891 | |
| Hyaluronidase | Sigma Aldrich | H3506 | |
| Sterile razor blades | Fisher Scientific | 12443170 | |
| Sterile scalpel | Fisher Scientific | 11758353 | |
| Sterile micro-dissecting scissors | Sigma Aldrich | S3146 |
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