Une méthode enzymatique pour secourir Cellules souches mésenchymateuses à partir d'échantillons coagulés moelle osseuse

Summary

Les cellules souches mésenchymateuses sont généralement obtenues à partir de la moelle osseuse et nécessitent une culture d’expansion. Lorsque les échantillons coagulent avant d’être traités, un protocole utilisant le médicament thrombolytique (enzymatique) urokinase peut être appliqué pour dégrader le caillot. Ainsi, les cellules sont libérées et disponibles pour la culture d’expansion. Ce protocole offre une alternative rapide et peu coûteuse au rééchantillonnage.

Abstract

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) - généralement obtenues à partir de moelle osseuse - nécessitent souvent une culture d’expansion. Notre protocole utilise l’urokinase de grade clinique pour dégrader les caillots dans la moelle osseuse et libérer les CSM pour une utilisation ultérieure. Ce protocole offre une alternative rapide et peu coûteuse au rééchantillonnage de la moelle osseuse. La moelle osseuse est une source majeure de CSM, qui sont intéressantes pour l’ingénierie tissulaire et les thérapies à base de cellules souches autologues. Lors du retrait, la moelle osseuse peut coaguler, car elle comprend tout le système hématopoïétique. Les caillots qui en résultent contiennent également des CSM qui sont perdues pour la culture d’expansion ou la thérapie directe par cellules souches. Nous avons constaté que 74 % des échantillons de moelle osseuse canine contenaient des caillots et produisaient moins de la moitié du nombre de cellules souches attendues des échantillons non coagulés. Ainsi, nous avons développé un protocole de digestion enzymatique de ces caillots afin d’éviter un rééchantillonnage de la moelle osseuse coûteux et intensif en main-d’œuvre. L’urokinase - un médicament thrombolytique cliniquement approuvé et facilement disponible - élimine presque complètement les caillots de la moelle osseuse. En conséquence, les ponctions de moelle osseuse traitées produisent un nombre similaire de CSM que d’échantillons non coagulés. De plus, après le traitement à l’urokinase, les cellules ont conservé leur activité métabolique et la capacité de se différencier en lignées chondrogéniques, ostéogéniques et adipogènes. Notre protocole récupère les échantillons de sang coagulé et de moelle osseuse sans affecter la qualité des cellules. Ce rééchantillonnage obsolète réduit considérablement les coûts d’échantillonnage et permet l’utilisation d’échantillons coagulés pour la recherche ou la thérapie.

Introduction

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) jouent un rôle majeur dans la médecine régénérative et de l'ingénierie tissulaire. Ils peuvent migrer, se différencier en différents types de cellules et ^une greffer, ce qui les rend idéales pour les candidats thérapies autologues ^2,3. Dernièrement, des essais cliniques utilisant MSC pour les os et la réparation du cartilage, maladie du greffon contre l'hôte ou une maladie cardiaque ont été lancés ^4. Ces cellules souches mésenchymateuses peuvent être récoltées à partir du tissu du cordon ombilical ou adipeux, mais les résultats les plus prometteurs ont été obtenus à partir de la moel....

Protocol

REMARQUE: ponctions de moelle osseuse humaines de la crête iliaque ont été recueillies de consentir donateurs avec l'approbation du comité d'éthique du canton de Lucerne. Aspirats de moelle osseuse Canine de la crête iliaque ont été recueillies avec consent.Human de propriétaire de chien (env. 20 ml) et canin (env. 10 ml) aspirats de moelle osseuse étaient anti-coagulé par addition de 15 ml de citrate de sodium à 3,8% immédiatement après le retrait dans la salle d'opération. Les échantillons ont été transférés à l'environnement du laboratoire de traitement du même jour comme retirée.

1. Préparation de Urokinase (Avant le 1 <....

Results

Les faits que 74% des échantillons de moelle osseuse canins (n = 54) contenait des caillots quand ils sont arrivés dans notre laboratoire (figure 1A) ainsi diminué les rendements de MSC partir de ces échantillons, nous a fait croire qu'un nombre considérable de MSC a été piégé dans les caillots . En effet, une simple DAPI-taches de matériau de caillot coupe confirme la présence de cellules nucléées à haute densité (figure 1B). Cela conduit finalement à un faible nombre de cellules souch.......

Discussion

Régulièrement on échantillonne moelle osseuse tandis que le patient subit une intervention chirurgicale (dans notre cas de chirurgie principalement la colonne vertébrale), avec l'avantage que seul le travail peu supplémentaire doit être effectué par le personnel de la salle d'opération. Même si les échantillons sont mélangés avec du citrate de sodium immédiatement après le retrait, de nombreux échantillons ont été partiellement coagulé quand ils sont arrivés dans le laboratoire pour le traitement. A ce stade, le.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
			moyens de base
PenStrep 100X	Gibco	15140122
Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
MEM Alpha avec nucléoside, avec glutamine stable	Amimed	1-23S50-I
FBS Inactivé par la chaleur	Amimed	2-01F36-I
Amphotéricine B	Applichem	A1907
Milieu adipogène Composants
DMEM-HAM F12 + GlutaMAX	Amimed	1-26F09-I
Insuline  ;	Sigma	I5500
Sérum de lapin	Gibco	16120099
Dexaméthasone	Applichem	D4902
3-Isobutyl-1-méthylxanthine	Sigma	I5879
Biotine  ;	Sigma	B4639
Rosiglitazone  ;	Sigma	R2408
Pantothénate  ;	Sigma	P5155
Huile Rouge-O  ;	Sigma	O0625
Composants du milieu ostéogène Acide
L-ascorbique 2-phosphate	Sigma	A8960
ß ;-glycérophosphate	Sigma	G9422
Nitrate d’argent (AgNO3)	Sigma	S6506
			milieu chondrogène
Biopad - dispositif médical en forme d’éponge	Euroresearch
L-proline  ;	Sigma	P5607
Insuline-Transferrine-Sélénium X	Gibco	51500056
Facteur de croissance transformant humain-&beta ; 1  ;	Peprotech	100-21
Alcian Blue 8GX	Sigma	A3157
Nucléaire rapide rouge	Sigma	N8002
Générique
Tri-Sodium citrate dihydrate	Applichem	A3901
PBS	Applichem	964.9100
Urokinase	Medac	1976826
0,5 % Trypsine-EDTA	Gibco	15400054
coloration Giemsa	Applichem	A0885
Formaldéhyde	Applichem	A0877
Acide sulfurique (H2SO4)	Applichem	A0655
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Applichem	A1584
Chlorure de magnésium (MgCl2)	Applichem	A3618
Chlorhydrate de guanidine	Applichem	A1499
Consommables
50 ml tube de réaction	Axygen	SCT-50ML-25-S
seringue de 10 ml	Braun	4606108V
Aiguille stérilisante (22G)	Braun	4657624
1,7 ml Microtubes	Brunschwig	MCT-175-C
100 &mu ; Filtre à cellules m	Falcon	6.05935
pince stérile	Bastos Viegas, SA	489-001
scalpel stérile	Braun	5518059
Primaria boîte à cuture cellulaire	Falcon	353803
C-Chip Neubauer Improved	Bioswisstech	505050
culture cellulaire - Flacon T300	TPP	90301
Equipement
Armoire de biosécurité microbiologique classe II	Skan	82011500
bain-marie	Memmert	1305.0377
Stripettes Pipette sérologique 5ml	Corning	4487-200ea
microscope	Olympus	CKX41
incubateur humidifié Heracells 240	Thermo 51026331
Heraeus Multifuge 1S-R	Thermo scientific	75004331