Un metodo enzimatico per salvare cellule staminali mesenchimali da coagulata midollo osseo da analizzare

Summary

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

Abstract

Mesenchymal stem cells (MSCs) – usually obtained from bone marrow – often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase – a clinically approved and readily available thrombolytic drug – clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Introduction

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) svolgono un ruolo importante nella medicina rigenerativa e dell'ingegneria dei tessuti. Essi possono migrare, differenziarsi in vari tipi di cellule ¹ e innestare, che li rende i candidati ideali per terapie autologhe ^2,3. Ultimamente, gli studi clinici che utilizzano cellule staminali mesenchimali per la riparazione delle ossa e della cartilagine, graft versus host disease o malattia cardiaca sono stati lanciati ^4. Questi MSC possono essere raccolte dal tessuto adiposo o cordone ombelicale, ma i risultati più promettenti sono stati ottenuti da midollo osseo cellule staminali derivate ^5.

La cresta iliaca permette di raccogliere una notevole quantità di midollo osseo e serve quindi come sito principale di aspirazione ^6. Tuttavia, la qualità del aspirato diminuisce con l'aumento del volume di midollo osseo prelevato. Mentre i primi 5 ml di midollo osseo contengono cellule staminali mesenchimali di alta qualità, ritiro delle maggiori volumi porta alla diluizione del aspirato con sangue periferico fROM l'osso altamente vascolarizzato ^7. A causa delle attuali megacariociti e piastrine, aspirati di midollo osseo sono inclini a coagulazione, a meno di utilizzare anticoagulanti. Ma anche con anticoagulanti, possono verificarsi la formazione di coaguli.

Nel midollo osseo, cellule staminali mesenchimali rappresentano solo una piccola parte del pool di cellule totale ⁸ e devono essere espansa in coltura per più ingegneria dei tessuti o applicazioni terapeutiche ^4. La qualità di una tale cultura dipende in gran parte la piscina cellula iniziale, vale a dire., La diversità e un alto numero di partenza ^9. Basso numero di cellule staminali mesenchimali da prelievi possono essere in parte spiegati dalla variabilità dei donatori. D'altra parte, MSC da campioni bassa qualità richiedono tempo maggiore di cultura e passaging esteso a raggiungere il numero desiderato di celle. In entrambi i casi, passaging esteso è fonte di senescenza cellulare e può portare alla perdita di differenziazione potenziale ^10. Pertanto, i protocolli in grado di massimizzare cellulare y ottimizzatoield ed evitare effetti nocivi devono essere sviluppati ^11,12.

Quando abbiamo cominciato a lavorare con MSC canina, siamo stati sorpresi di vedere che circa tre su quattro campioni di midollo osseo canini contenuti coaguli, mentre i campioni umani fortunatamente coagulato (uno su dieci) erano meno frequenti. D'altra parte è stata una sorpresa, che abbiamo osservato rendimenti molto più bassi di cellule staminali mesenchimali da campioni coagulati. Per risolvere il problema ricorrente dei campioni coagulati, abbiamo sviluppato il protocollo con il urokinase droga trombolitico invece di ricampionamento.

Terapie trombolitici possono contrastare in pericolo di vita situazioni come l'occlusione dei vasi sanguigni, causando un attacco di cuore, ictus o embolie a causa di coagulazione indesiderati. Funzionano degradazione dei coaguli attraverso taglio enzimatico di fibrina da plasmina e del plasminogeno attivatori enzimatici. Nonostante l'ampio uso per il trattamento di pazienti, solo pochissime pubblicazioni esistono che le attività trombolitici utilizzate, c'eper applicazioni di laboratorio per salvare campioni coagulati, soprattutto concentrandosi su linfociti. Nel 1987, Niku et al. descritto l'uso di streptochinasi per dissolvere i coaguli di sangue con conseguente linfociti funzionali ¹³ e quattro anni dopo, De Vis et al. esteso l'uso di streptochinasi per isolare cellule leucemiche dal sangue e del midollo osseo per le applicazioni di citometria a flusso ^14. Una pubblicazione più recente suggerisce l'uso di Alteplase per la diagnostica del cancro ^15. Mentre si utilizza lo stesso approccio enzimatico, il nostro protocollo si concentra su l'isolamento di cellule staminali mesenchimali multipotenti forma di midollo osseo per fornire uno strumento per i ricercatori nel campo delle cellule staminali.

Protocol

NOTA: aspirati di midollo osseo umano dalla cresta iliaca sono stati raccolti da donatori consenzienti, con l'approvazione del comitato etico del cantone di Lucerna. Canine aspirati di midollo osseo da cresta iliaca sono stati raccolti con consent.Human del proprietario del cane (circa. 20 ml) e canino (circa. 10 ml) aspirati di midollo osseo erano anti-coagulato per aggiunta di 15 ml di 3,8% di citrato di sodio immediatamente dopo la sospensione in sala operatoria. I campioni sono stati trasferiti al ambiente di la…

Representative Results

I fatti che il 74% dei campioni di midollo osseo canino (n = 54) conteneva coaguli quando sono arrivati ​​nel nostro laboratorio (Figura 1A) insieme con diminuzione dei rendimenti MSC da questi campioni, ci ha fatto credere che un numero considerevole di MSC era intrappolato all'interno dei coaguli . Infatti, un semplice DAPI-macchia di materiale coagulo sezionata conferma la presenza di cellule nucleate in alta densità (Figura 1B). Questo conduce infine a un basso numero di ce…

Discussion

Ordinariamente campioniamo midollo osseo mentre il paziente sta subendo chirurgia (nel nostro caso principalmente chirurgia della colonna vertebrale), con il vantaggio che solo il lavoro poco aggiuntiva deve essere effettuata da personale della sala operatoria. Anche se i campioni vengono mescolati con citrato di sodio immediatamente dopo il ritiro, molti campioni sono stati parzialmente coagulato quando sono arrivati ​​in laboratorio per l'elaborazione. In questa fase, ricampionamento per sostituire i campioni …

Materials

Basal Medium Components
PenStrep 100X	Gibco	15140122
Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine	Amimed	1-23S50-I
FBS Heat Inactivated	Amimed	2-01F36-I
Amphotericin B	Applichem	A1907
Adipogenic Medium Components
DMEM-HAM F12 + GlutaMAX	Amimed	1-26F09-I
Insulin	Sigma	I5500
Rabbit serum	Gibco	16120099
Dexamethasone	Applichem	D4902
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma	I5879
Biotin	Sigma	B4639
Rosiglitazone	Sigma	R2408
Pantothenate	Sigma	P5155
Oil Red-O	Sigma	O0625
Osteogenic Medium Components
L-ascorbic acid 2-phosphate	Sigma	A8960
ß-glycerophosphate	Sigma	G9422
Silver nitrate (AgNO3)	Sigma	S6506
Chondrogenic Medium Components
Biopad – sponge shaped medical device	Euroresearch
L-proline	Sigma	P5607
Insulin-Transferrin-Selenium X	Gibco	51500056
Human transforming growth factor-β1	Peprotech	100-21
Alcian Blue 8GX	Sigma	A3157
Nuclear fast red	Sigma	N8002
Generic
Tri-Sodium citrate dihydrate	Applichem	A3901
PBS	Applichem	964.9100
Urokinase	Medac	1976826
0.5% Trypsin-EDTA	Gibco	15400054
Giemsa stain	Applichem	A0885
Formaldehyde	Applichem	A0877
Sulfuric acid (H2SO4)	Applichem	A0655
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Applichem	A1584
Magnesium chloride (MgCl2)	Applichem	A3618
Guanidine hydrochloride	Applichem	A1499
Consumables
50 mL reaction tube	Axygen	SCT-50ML-25-S
10 mL syringe	Braun	4606108V
Sterican needle (22G)	Braun	4657624
1.7 mL Microtubes	Brunschwig	MCT-175-C
100 μm cell strainer	Falcon	6.05935
sterile forceps	Bastos Viegas, SA	489-001
sterile scalpel	Braun	5518059
Primaria cell cuture dish	Falcon	353803
C-Chip Neubauer Improved	Bioswisstech	505050
cell culture flask – Flask T300	TPP	90301
Equipment
Microbiological biosafety cabinet class II	Skan	82011500
water bath	Memmert	1305.0377
Stripettes Serological Pipette 5ml	Corning	4487-200ea
microscope	Olympus	CKX41
humidified incubator Heracells 240	Thermo scientific	51026331
Heraeus Multifuge 1S-R	Thermo scientific	75004331