Xenopus laevis כמודל לזיהוי תרגום ירידת ערך
Summary
Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.
Abstract
סינתזת חלבון היא תהליך בסיסי לביטוי גנים המשפיעים על תהליכים ביולוגיים מגוונים בעיקר הסתגלות לתנאי סביבה. צעד הייזום, הכולל הרכבה של תת-יחידות ריבוזומלי בmRNA קודון החניכה, הגורם מעורב ייזום כולל eIF4G1. פגמים בשלב זה שיעור הגבלה של תרגום צמודים להפרעות שונות. כדי לחקור את ההשלכות הפוטנציאליות של deregulations כזה, Xenopus laevis ביציות מהוות מודל אטרקטיבי עם מעלות גבוהות של שימור של מנגנונים תאיים ומולקולריים חיוניים עם אדם. בנוסף, במהלך התבגרות meiotic, ביציות תעתיק מודחקות וכל החלבונים הדרושים מתורגמים מקיימים מראש mRNAs, נגזר אימהי. מודל זה מאפשר זול mRNA אקסוגניים להשתלב בצורה מושלמת עם תרגום יעיל. כאן מתואר פרוטוקול להערכת תרגום עם גורם עניין (כאן eIF4G1) באמצעות storאד mRNA האימהי שהם ראשון להיות polyadenylated ותורגם במהלך הבשלת ביצית כקריאת נתונים פיזיולוגית. בתחילה, ה- mRNA synthetized ידי שעתוק במבחנה של פלסמידים של עניין (כאן eIF4G1) מוזרקים בביציות וקינטיקה של הבשלת ביצית על ידי זיהוי התפלגות רמינל שלפוחיות נקבע. יעד mRNA האימהי למד הוא סרין / Mos תראונין חלבון-קינאז. polyadenylation והתרגום הבא שלה נחקרים יחד עם הביטוי וזירחון של חלבונים של Mos מפל איתות מעורב בהבשלת ביצית. וריאציות של הפרוטוקול הנוכחי לשים קדימה פגמי translational גם הציעו להדגיש תחולתה הכללית. לאור ראיות שמתעוררות סינתזת חלבון חריגה עשויה להיות מעורבת בפתוגנזה של הפרעות נוירולוגיות, מודל כזה מספק את ההזדמנות כדי להעריך בקלות ירידת ערך זו ולזהות מטרות חדשות.
Introduction
חלבונים הם מרכיבים חיוניים של חיים סלולריים ובכך בקנה מידה גדולה יותר של האורגניזם. הם להבטיח רוב הפונקציות סלולריות כוללים מבנה, תחבורה, קטליזה תגובה, רגולציה, ביטוי גנים וכו 'הביטוי שלהם הוא התוצאה של מנגנון מורכב של תרגום המאפשר המרה של mRNA לחלבון. התרגום הוא נתון לבקרה שונות להסתגל ולהסדיר ביטוי גנים על פי צרכי התא, במהלך התפתחות והתמיינות, הזדקנות, לחצים פיסיולוגיים או פתולוגי גילויים.
תרגום מחולק ל 3 שלבים (ייזום, התארכות וסיום) ומתנות 3 מערכות תרגום ייזום כדי לענות על צרכי אלה: כובע תלוי, כובע-עצמאי באמצעות מגזר הפנימי הריבוזום כניסה (IRES) מבנים וכובע-עצמאי משפרי תרגום ( CITE).
רוב mRNA אוקריוטים מתורגמים בכובע-depeאופן ndent באמצעות כובע 5'-טריפוספט 7-methylguanosine המשמש כתכונת זיהוי במהלך סינתזת חלבון. כובע זה נקשר לeIF4E, רכיב של מורכב eIF4F עם eIF4G1 וeIF4A. קשור עם שותפים אחרים כמו פולי () חלבון מחייב (PABP), eIF2-GTP-Met-tRNA Met, גורמי חניכת תרגום אלה מאפשרים לcircularize mRNA ולשפר את הנגישות שלה לצורות מורכבות 43s עד ייזום אוגוסט קודון הכרת 1. אירוע זה מתאים לסוף כלומר ייזום תרגום, הצעד הראשון של תרגום.
תרגום Cap-עצמאי משמש קידוד mRNA לחלבונים חיוניים בתנאים הדגישו כי לגרום להתפשטות תאים למשל ואפופטוזיס. מנגנון זה כולל מבנים משניים בmRNA 5'- אזור מתורגם (UTR) נקרא IRES, סוף carboxy מסוף של eIF4G1 הקשורים eIF4A והמורכב 43s. כריכה של זה 43s מראש הייזום גomplex לIRES יוזם את התרגום העצמאי הכובע ללא הצורך בגורם eIF4E 2,3.
לבסוף, מנגנון תרגום אחר עדיין לא הבין היטב תומך בפעילות תרגום כובע-העצמאי הזה, לפי תנאים הדגישו באמצעות CITE מבנים הנמצאים בתוך ה- mRNA 4 UTR.
דרך אלה מצבים השונים של התרגום השונה על ידי צעדי החניכה שלהם, תרגום משחק תפקיד קריטי בהומאוסטזיס סלולארי וכל שינוי באחד מהתהליכים אלה ובכך ישפיעו האורגניזם עם קטן לתופעות בקנה מידה גדולות. ואכן, החניכה היא צעד שיעור הגבלת שלטון תהליכי התרגום הנכון של mRNA לחלבונים ולכן היעד של מספר רב של בקרות ונקודות תקנה 5. בין אם מדובר באפשרות השנייה או לרכיבים של תהליכים אלה, אם אחד הופך להיות פגומים, זה יהיה לטרוד את האיזון שנקבע בתא ובכך עלול להוביל לקונדי פתולוגייםמשא. בהקשר זה, מוטציות בגורמי תרגום היו מעורבות במספר הפרעות, כולל הפרעות ניווניות כגון `leukoencephalopathy עם ההיעלמות לבנה matter' (מקטע eIF2B1-5) 6, בתסמונת וולקוט-Rallison (קידוד EIF2AK3 גן ל"הערכה") 7, שעלול להיות ב המחלה (p.R1205H eIF4G1) פרקינסון 8. לכן חשוב לבצע מחקרים תאיים ומולקולריים של חלבוני מוטציה אלה כדי להגדיל את הידע שלנו על התפתחות מחלה ועל התהליך הכללי של חניכת תרגום.
כדי לבצע את המחקרים הללו, זה חיוני כדי לבחור את הדגמים המתאימים ביותר לקיים את ההשלכות של מוטציות אלה Xenopus laevis ביציות מותאמות במיוחד גם בשל המאפיינים הפיסיולוגיים וביוכימיים שלהם:. סינכרוניות הפיזיולוגית (חסום בG2 שלב של מחזור התא) , קיבולת גבוהה של סינתזת חלבון (200-400 ng / יום / ביצית), מספר גבוה של OOC חולץytes מאותה חיה (800-1,000 ביציות / נקבה) וגודל תא (1.2-1.4 מ"מ קוטר) המאפשר המניפולציה שלהם. Microinjection של ביציות Xenopus עם mRNA מסונתז בקלות ניתן לבצע כדי לנתח את הפעולות תרגום. בתצוגה זו מציג יתרונות אחרים. בהתחשב במהירות של התקדמות מיוזה ותרגום לאחר microinjection mRNA (~ שעה 24), ביצית Xenopus מייצגת מערכת מהירה בהשוואה למערכות מחדש סלולריות (שחולצו מE.coli, חיידקי חיטה או reticulocyte ארנב …) שבו mRNA הוא מתורגם עם שיעור מופחת ותרגום במהירות נמוכה יותר. אז, את ההשפעות של מוטציה הציגה בmRNA תהיה במהירות לצפייה ולמד בקלות בכמה ביציות. יתרון נוסף של ביציות Xenopus הוא שmRNAs האימהי הוא סמוי ותרגום חלבון חסום לפני גירוי פרוגסטרון. תוספת של פרוגסטרון היא אפוא אמצעי טוב של השליטה האינדוקציה התרגום. p cytoplasmicolyadenylation אינו מתרחש במהלך oogenesis. זה מתחיל בהבשלת ביצית בביציות מגורה פרוגסטרון בצו זמני וממשיך לאורך התפתחות מוקדמת ויכול לשמש כדי לחקור את השלבים השונים של תרגום.
Polyadenylation של Mos mRNA הוא בין הראשונים שמתרחשים והוא שייך עם אורורה / Eg2, היסטון-כמו B4 mRNA לכיתה של גנים "התבגרות המוקדמת" כהגדרתו בCharlesworth et al. (2004) 9. האינדוקציה translational של mRNA "מאוחר" כגון Cyclin A1 וCyclin B1 מתרחשת בערך בזמן של התמוטטות נבטי שלפוחית (GVBD). Mos mRNA מקודד קינאז סרין / תראונין חלבון. התרגום שלה הוא קריטי שכן הוא גורם למפל קינאז מפה שבעקיפין מפעיל את הבשלת הביצית. ואכן, בתגובה לפרוגסטרון, polyadenylation של Mos mRNA מוגבר באמצעות תהליך הכרוך אורורה / Eg2 חלבונים רגולטוריים וחלבוני RNA מחייב אחרים עם ההדואר 3'UTR של Mos mRNA. polyadenylation המוגבר של Mos mRNA מוביל לעלייה של רמת חלבון mos, אשר בתורו מפעילה MEK1. תהליך זה מתווך את ההפעלה של קינאז מוסדר האיתות תאי 2 (ERK2) (איור 1). מפל איתות זה יכול לגרום לאז M-שלב התבגרות קידום גורמים, מורכב נוצר על ידי קינאז Cyclin B וCdc2, וסופו של דבר גורם לחידוש meiotic.
לכן בXenopus laevis ביציות, יכול לשמש בקלות המחקר של mRNA האימהי כגון Mos לבדוק translatability עם כמה נקודות קצה מpolyadenylation היעילה שלהם לתרגום של כמה Mos איתות רכיבים, הכולל גם את קביעת שיעור GVBD. מערכת זו היא מעניינת ולכן כדי להעריך את ההשלכות הראשונות של מוטציות בגורמי חניכת תרגום ללא התערבות של mRNA עיבד חדש או של יעילות transfection, בעיות לעתים קרובות מתרחשות עם eukaryמחקרי תא otic.
כאן, פרוטוקול הוקם בי mRNAs eIF4G1 מוטצית microinjected בXenopus laevis ביציות ובתרגום של mRNA האימהי נבדק. בנוכחות של פגם בהתקדמות GVBD, Mos polyadenylation mRNA שהוא חיוני להתקדמות דרך מחזור תא ביצית meiotic ולתרגום הבא של mRNAs כיתה המוקדם והמאוחר הוא הוברר. זירחון אורורה / Eg2 וERK הוא גם למד כדי לאשר את התוצאה של deregulation.Thus mos, ביציות Xenopus מייצגות דרך פשוטה כדי לנתח את הפעולות שונות של תרגום mRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
תרגום הוא מנגנון המעורב בphysiopathology של הפרעות אנושיות רבות, כולל כמה מחלות ניווניות. למשל במחלת פרקינסון כמה דיווחים הציעו ירידת הערך בתרגום הקשורים מוטציות תורשתיות 8,12,13.
כמה דגמים סלולריים זמינים ללמוד תרגום. כאן, על מנת לל?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grant from INSERM, University of Lille 1, University of Lille 2, Regional Hospital Center of Lille (CHR de Lille). MCCH acknowledges supports from the Fondation de France and wishes to thank IRCL, Pr. Sonenberg for the gift of the V5-plasmids, Dr. Dissous (Pasteur Institute, Lille) for the gift of anti-GFP antibodies, UMS 3387 (University of Rennes) where Xenopus oocytes are purchased and Dr Taymans (JPArc, Lille) for critical reading of the manuscript text.
Materials
| Tricaine methane sulphonate | Sandoz | MS-222 | oocytes handling |
| Forceps | Moria | Dumont MC40 | |
| Streptomycin/penicillin | Sigma | 781 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Tetracyclin | Sigma | T7660 | |
| Veterinarian absorbable Vicryl thread | Johnson&Johson Intl | JV1205 | |
| Collagenase A | Roche diagnostics | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | Preparation of synthetic mRNA |
| DNAse/RNAse free H2O | Life Technologies | 10977 | |
| Sodium Acetate | Merck | 6268 | |
| Absolute ethanol | Sigma | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| Ethidium bromide 10 mg/mL | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE® Kit | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Formaldehyde 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | |
| Gel Doc Imager | Biorad | ||
| Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | microinjection |
| Replacement Glass 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0,45 µm filter | Millipore | SLHA025NB | |
| Progesterone | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | Western Blot |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4612 | |
| leupeptin | Sigma | L8511 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| sodium vanadate | Sigma | S6508 | |
| Laemmli buffer | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036 and -1096 | |
| horizontal semi-dry blotting system | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL Membrane | Amersham Life Science | 10401180 | |
| Methanol | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Red (0,5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Cell Signaling | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anti-Rsk | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Advanced ECL Detection System | Amershan Life Science | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | polyadenylation assay |
| TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) | Qiagen | 79306 | |
| Chloroform | Sigma | 31998-8 | |
| Isopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| RTL buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNAse free DNAse set | Qiagen | 79254 | |
| Primers | Eurogentec | ||
| T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| High capacity c-DNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq polymerase | Life Technologies | 10342020 |
References
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Bio. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lopez-Lastra, M., Rivas, A., Barria, M. I. Protein synthesis in eukaryotes: the growing biological relevance of cap-independent translation initiation. Biol Res. 38 (2-3), 121-146 (2005).
- Terenin, I. M., Andreev, D. E., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N. A novel mechanism of eukaryotic translation initiation that is neither m7G-cap-, nor IRES-dependent. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1807-1816 (2013).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
- Van der Knaap, M. S., Leegwater, P. A., Könst, A. A., Visser, A., Naidu, S., Oudejans, C. B., Schutgens, R. B., Pronk, J. C. Mutations in each of the five subunits of translation initiation factor eIF2B can cause leukoencephalopathy with vanishing white matter. Ann Neurol. 51 (2), 264-270 (2002).
- Senée, V., Vattem, K. M., Delépine, M., Rainbow, L. A., Haton, C., Lecoq, A., et al. Wolcott-Rallison Syndrome: clinical, genetic, and functional study of EIF2AK3 mutations and suggestion of genetic heterogeneity. Diabetes. 53 (7), 1876-1883 (2004).
- Chartier-Harlin, M. C., Dachsel, J. C., Vilariño-Güell, C., Lincoln, S. J., Leprêtre, F., Hulihan, M. M., et al. Translation initiator EIF4G1 mutations in familial Parkinson disease. Am J Hum Genet. 89 (3), 398-406 (2011).
- Charlesworth, A., Cox, L. L., MacNicol, A. M. Cytoplasmic polyadenylation Element (CPE)- and CPE-binding Protein (CPEB)-independent mechanisms regulate early class maternal mRNA translational activation in Xenopus oocytes. J Biol Chem. 279 (17), 17650-17659 (2004).
- Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis. J Morphol. 136, 153-180 (1972).
- Rassa, J. C., Wilson, G. M., Brewer, G. A., Parks, G. D. Spacing constraints on reinitiation of paramyxovirus transcription: the gene end U tract acts as a spacer to separate gene end from gene start sites. Virology. 274, 438-449 (2000).
- Lin, W., Wadlington, N. L., Chen, L., Zhuang, X., Brorson, J. R., Kang, U. J. Loss of PINK1 attenuates HIF-1α induction by preventing 4E-BP1-dependent switch in protein translation under hypoxia. J Neurosci. 34 (8), 3079-3089 (2014).
- Martin, I., Kim, J. W., Lee, B. D., Kang, H. C., Xu, J. C., Jia, H. 2., Stankowski, J., et al. Ribosomal protein s15 phosphorylation mediates LRRK2 neurodegeneration in Parkinson’s disease. Cell. 57 (2), 472-485 (2014).
- Cohen, S., Au, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J Vis Exp. (24), (2009).
- Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. (69), e4449 (2012).
- Keiper, B. D., Rhoads, R. E. Translational recruitment of Xenopus maternal mRNAs in response to poly(A) elongation requires initiation factor eIF4G-1. Dev Biol. 206 (1), 1-14 (1999).
- Wakiyama, M., Imataka, H., Sonenberg, N. Interaction of eIF4G with poly(A)-binding protein stimulates translation and is critical for Xenopus.oocyte maturation. Curr Biol. 10 (18), 1147-1150 (2000).
- Sheets, M. D., Wu, M., Wickens, M. Polyadenylation of c-mos mRNA as a control point in Xenopus meiotic maturation. Nature. 374 (6522), 511-516 (1995).
- Gebauer, F., Richter, J. D. Synthesis and function of Mos: the control switch of vertebrate oocyte meiosis. Bioessays. 19 (1), 23-28 (1997).
- Le Sommer, C., Lerivray, H., Lesimple, M., Hardy, S. Xenopus as a model to study alternative splicing in vivo. Biol Cell. 99 (1), 55-65 (2007).
- Au, S., Cohen, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis.oocytes as a system for studying nuclear transport of viruses. Methods. 51 (1), 114-120 (2010).
- Gotoh, T., Villa, L. M., Capelluto, D. G., Finkielstein, C. V. Regulatory pathways coordinating cell cycle progression in early Xenopus development. Results Probl Cell Differ. 53, 171-199 (2011).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
- Moreno, J. A., Halliday, M., Molloy, C., Radford, H., Verity, N., Axten, J. M., et al. Oral treatment targeting the unfolded protein response prevents neurodegeneration and clinical disease in prion-infected mice. Sci Transl Med. 5 (206), 206ra138 (2013).
- Doyle, K. M., Kennedy, D., Gorman, A. M., Gupta, S., et al. Unfolded proteins and endoplasmic reticulum stress in neurodegenerative disorders. J Cell Mol Med. 15 (10), 2025-2039 (2011).
- Gandin, V., Sikström, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), e51455 (2014).
