Xenopus laevis som en modell för att identifiera Översättning Nedskrivningar
Summary
Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.
Abstract
Proteinsyntes är en grundläggande process för att genuttryck påverkar olika biologiska processer, särskilt anpassning till miljöförhållanden. Den inledande steget, som innebär monteringen av ribosomala subenheter på mRNA-initieringskodonet, involverade inledande faktor inklusive eIF4G1. Defekter i denna hastighetsbegränsande steget av translation är kopplade till olika sjukdomar. För att studera de potentiella konsekvenserna av sådana avregleringar, laevis Xenopus oocyter utgör en attraktiv modell med hög grad av bevarande av viktiga cellulära och molekylära mekanismer med människa. Dessutom, under meiotisk mognad, oocyter transkriptiontryckt och alla nödvändiga proteiner är översatta från redan existerande, maternella mRNA. Denna billig modell möjliggör exogen mRNA för att bli helt integrerad med en effektiv översättning. Här beskrivs ett protokoll för att bedöma översättningen med en faktor av intresse (här eIF4G1) med hjälp Stored moderns mRNA som är de första som polyadenylerat och översatt under oocytmognad som en fysiologisk avläsning. Först mRNA syntetiseras genom transkription in vitro av plasmider av intresse (här eIF4G1) injiceras i oocyter och kinetiken för oocytmognad by Germinal vesikelnedbrytning detektering bestäms. Den studerade moderns mRNA mål är serin / treonin-proteinkinas mos. Dess polyadenylering och dess efterföljande translation utreds tillsammans med uttryck och fosforylering av proteiner av mos signalerings kaskad inblandade i oocytmognad. Variationer av det nuvarande protokollet att lägga fram translationella defekter föreslås också att understryka dess allmänna tillämplighet. Mot bakgrund av nya bevis för att avvikande proteinsyntes kan vara inblandade i patogenesen av neurologiska sjukdomar, ger en sådan modell möjlighet att enkelt bedöma denna försämring och identifiera nya mål.
Introduction
Proteiner är väsentliga delar av cellulära liv och därmed på större skala av organismen. De garanterar en majoritet av cellulära funktioner inklusive struktur, transport, reaktions katalys, reglering, genexpression etc. Deras uttryck är resultatet av en komplex mekanism av translation möjliggör konvertering av ett mRNA till protein. Översättningen kastas olika kontroller för att anpassa sig och för att reglera genuttrycket enligt cell behov, under utveckling och differentiering, åldrande, fysiologiska påkänningar eller patologiska manifestationer.
Översättning är indelat i 3 faser (initiering, töjning och terminering) och presenterar 3 system inledande översättnings för att möta dessa behov: cap beroende, cap oberoende via inre Ribosom Entry Segment (IRES) strukturer och cap-oberoende översättnings Förstärkare ( CITE).
De flesta eukaryota mRNA översätts i en cap-Dependent sätt via 7-metylguanosin 5'-trifosfat lock som fungerar som en funktionen erkännande under proteinsyntes. Detta tak binder till eIF4E, en komponent i eIF4F komplex med eIF4G1 och eIF4A. Associerad med andra partner såsom poly (A) protein (PABP), eIF2-GTP-Met-tRNA-Met, dessa översättnings initieringsfaktorer tillåter att cirkularisera mRNA och förbättra dess tillgänglighet till former 43S-komplexet tills augusti initieringskodonet erkännande 1. Denna händelse motsvarar utgången av translationsinitieringsstället dvs det första steget av translation.
Cap oberoende översättning används av mRNA som kodar för viktiga proteiner under stressade förhållanden som inducerar till exempel celltillväxt och apoptos. Denna mekanism innebär sekundära strukturer i mRNA 5'- otranslaterade regionen (UTR) kallas IRES, den karboxiterminala änden av eIF4G1 samband med eIF4A och 43S komplexet. Bindningen av denna 43S före inledande complex till IRES initierar locket oberoende översättning utan behov av eIF4E faktor 2,3.
Slutligen, en annan översättning mekanismen fortfarande inte förstått stöder detta lock oberoende översättningsverksamhet under stressade förhållanden via CITE strukturer belägna inom mRNA UTR 4.
Genom dessa olika typer av översättning som skiljer sig med sina invignings steg, spelar översättning en avgörande roll i cellulär homeostas och eventuella förändringar i en av dessa processer skulle alltså påverka organismen med små till stora skaleffekter. Faktum är initieringen ett hastighetsbegränsande steg som reglerar de korrekta processer av mRNA-translation till proteiner och är därför målet för många kontroller och regleringspunkter 5. Vare sig det är för den senare eller komponenter i dessa processer, om man visar sig vara defekt, kommer det störa jämvikten i cellen och därmed kan leda till patologisk Conditioner. I detta sammanhang har mutationer i översättningsfaktorer varit inblandade i flera sjukdomar, inklusive neurodegenerativa sjukdomar såsom `leukoencefalopati med försvinnande vit matter' (eIF2B1-5 subenhet) 6, i Walcott-Rallison syndrom (EIF2AK3 gen som kodar för PERK) 7, eventuellt i Parkinsons sjukdom (eIF4G1 p.R1205H) 8. Det är därför viktigt att genomföra cellulära och molekylära studier av dessa mutantproteiner för att öka vår kunskap om sjukdomsutveckling och på den allmänna processen för translationsinitiering.
För att utföra dessa studier, är det viktigt att välja den mest lämpliga modeller för att observera konsekvenserna av dessa mutationer Xenopus laevis oocyter är särskilt väl anpassade till följd av deras fysiologiska och biokemiska egenskaper. Fysiologisk synkronicitet (blockerad i fas G2 av cellcykeln) , hög kapacitet av proteinsyntes (200-400 ng / dag / äggcell), stort antal av extraherat OOCytes från samma djur (800-1000 oocyter / kvinnliga) och cellstorlek (1,2-1,4 mm i diameter) som underlättar deras manipulation. Mikroinjektion av Xenopus oocyter med syntetiserade mRNA kan lätt utföras för att dissekera steg översättnings. I den här vyn det ger andra fördelar. Med tanke på hastigheten på meios progression och översättning efter mRNA mikroinjektion (~ 24 h), representerar Xenopus oocyt ett snabbt system jämfört med ombildade cellulära system (som utvinns från E. coli, vetegroddar eller kaninretikulocyt …), i vilken en mRNA är översatt med en reducerad översättningshastighet och vid en lägre hastighet. Så, kommer effekterna av en mutation introducerades i en mRNA vara snabbt observerbara och enkelt undersökts i flera oocyter. En annan fördel med Xenopus oocyter är att moderns mRNA är latent och proteinöversättning blockeras innan progesteron stimulering. Tillsats av progesteron är alltså ett bra sätt att styra översättningen induktion. Cytoplasmisk polyadenylation inte inträffar under oogenes. Det börjar under oocytmognad i progesteron-stimulerade ägg i en temporal ordning och fortsätter under tidig utveckling och kan användas för att studera de olika stegen i översättning.
Polyadenyleringen av mos mRNA är bland de första att förekomma och den tillhör med Aurora A / EG2, Histon-liknande B4 mRNA klassen "tidig mognads" gener enligt definitionen i Charlesworth et al. (2004) 9. Den translationella induktion av "sena" mRNA såsom Cyclin A1 och cyklin B1 inträffar vid tiden för embryon vesikler uppdelning (GVBD). Mos mRNA kodar för ett serin / treonin-proteinkinas. Dess översättning är avgörande eftersom den leder MAP kinaskaskad som indirekt aktiverar oocytmognad. Faktiskt, som svar på progesteron, är polyadenylering av mos-mRNA förbättras genom en process som involverar Aurora A / EG2 regulatoriska proteiner och andra RNA-bindande proteiner med the 3'UTR av mos-mRNA. Denna ökade polyadenylering av mos-mRNA leder till en ökning av mos proteinnivå, vilket i sin tur aktiverar MEK1. Denna process medierar aktivering av extracellulära signalerreglerade kinas 2 (ERK2) (Figur 1). Detta signalkaskad kan sedan utlösa mognaden M-fas befrämjande faktorer, ett komplex bildat av Cyklin B och Cdc2 kinas, och så småningom resulterar i meiotisk återupptagande.
Därför i Xenopus laevis oocyter, kan studiet av moderns mRNA såsom mos lätt användas för att testa deras översättbarhet med flera ändpunkter från effektiv polyadenylering till översättning av flera mos signalering komponenter, däribland även fastställandet av GVBD takt. Detta system är därför intressant att utvärdera de första följderna av mutationer i translationsinitierings- faktorer utan inblandning av nyligen transkriberade mRNA eller av transfektionseffektivitet, problem som ofta uppstår med eukaryotiska cellstudier.
Här är ett protokoll som upprättades där muterade eIF4G1 mRNA injiceras i Xenopus laevis oocyter och översättning av moderns mRNA testas. I närvaro av en defekt i GVBD progression, mos mRNA polyadenylering som är nödvändig för progression genom äggcellen meiotiska cellcykeln och för efterföljande översättning av tidiga och sena klass mRNA konstateras. Fosforyleringen Aurora A / EG2 och ERK är också studeras för att bekräfta konsekvensen av MOS deregulation.Thus, Xenopus oocyter utgör ett enkelt sätt att analysera olika stegen i mRNA-translation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Översättning är en mekanism som är involverad i fysiopatologin av talrika humana störningar inklusive flera neurodegenerativa sjukdomar. Till exempel vid Parkinsons sjukdom flera rapporter föreslog försämring i översättning i samband med ärftliga mutationer 8,12,13.
Flera cellulära modeller finns tillgängliga för att studera översättning. Här, i syfte att studera de translation konsekvenserna av en mutation i eIF4G1 som fungerar som dominant negativ mutation reduc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grant from INSERM, University of Lille 1, University of Lille 2, Regional Hospital Center of Lille (CHR de Lille). MCCH acknowledges supports from the Fondation de France and wishes to thank IRCL, Pr. Sonenberg for the gift of the V5-plasmids, Dr. Dissous (Pasteur Institute, Lille) for the gift of anti-GFP antibodies, UMS 3387 (University of Rennes) where Xenopus oocytes are purchased and Dr Taymans (JPArc, Lille) for critical reading of the manuscript text.
Materials
| Tricaine methane sulphonate | Sandoz | MS-222 | oocytes handling |
| Forceps | Moria | Dumont MC40 | |
| Streptomycin/penicillin | Sigma | 781 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Tetracyclin | Sigma | T7660 | |
| Veterinarian absorbable Vicryl thread | Johnson&Johson Intl | JV1205 | |
| Collagenase A | Roche diagnostics | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | Preparation of synthetic mRNA |
| DNAse/RNAse free H2O | Life Technologies | 10977 | |
| Sodium Acetate | Merck | 6268 | |
| Absolute ethanol | Sigma | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| Ethidium bromide 10 mg/mL | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE® Kit | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Formaldehyde 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | |
| Gel Doc Imager | Biorad | ||
| Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | microinjection |
| Replacement Glass 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0,45 µm filter | Millipore | SLHA025NB | |
| Progesterone | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | Western Blot |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4612 | |
| leupeptin | Sigma | L8511 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| sodium vanadate | Sigma | S6508 | |
| Laemmli buffer | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036 and -1096 | |
| horizontal semi-dry blotting system | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL Membrane | Amersham Life Science | 10401180 | |
| Methanol | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Red (0,5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Cell Signaling | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anti-Rsk | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Advanced ECL Detection System | Amershan Life Science | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | polyadenylation assay |
| TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) | Qiagen | 79306 | |
| Chloroform | Sigma | 31998-8 | |
| Isopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| RTL buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNAse free DNAse set | Qiagen | 79254 | |
| Primers | Eurogentec | ||
| T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| High capacity c-DNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq polymerase | Life Technologies | 10342020 |
References
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Bio. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lopez-Lastra, M., Rivas, A., Barria, M. I. Protein synthesis in eukaryotes: the growing biological relevance of cap-independent translation initiation. Biol Res. 38 (2-3), 121-146 (2005).
- Terenin, I. M., Andreev, D. E., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N. A novel mechanism of eukaryotic translation initiation that is neither m7G-cap-, nor IRES-dependent. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1807-1816 (2013).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
- Van der Knaap, M. S., Leegwater, P. A., Könst, A. A., Visser, A., Naidu, S., Oudejans, C. B., Schutgens, R. B., Pronk, J. C. Mutations in each of the five subunits of translation initiation factor eIF2B can cause leukoencephalopathy with vanishing white matter. Ann Neurol. 51 (2), 264-270 (2002).
- Senée, V., Vattem, K. M., Delépine, M., Rainbow, L. A., Haton, C., Lecoq, A., et al. Wolcott-Rallison Syndrome: clinical, genetic, and functional study of EIF2AK3 mutations and suggestion of genetic heterogeneity. Diabetes. 53 (7), 1876-1883 (2004).
- Chartier-Harlin, M. C., Dachsel, J. C., Vilariño-Güell, C., Lincoln, S. J., Leprêtre, F., Hulihan, M. M., et al. Translation initiator EIF4G1 mutations in familial Parkinson disease. Am J Hum Genet. 89 (3), 398-406 (2011).
- Charlesworth, A., Cox, L. L., MacNicol, A. M. Cytoplasmic polyadenylation Element (CPE)- and CPE-binding Protein (CPEB)-independent mechanisms regulate early class maternal mRNA translational activation in Xenopus oocytes. J Biol Chem. 279 (17), 17650-17659 (2004).
- Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis. J Morphol. 136, 153-180 (1972).
- Rassa, J. C., Wilson, G. M., Brewer, G. A., Parks, G. D. Spacing constraints on reinitiation of paramyxovirus transcription: the gene end U tract acts as a spacer to separate gene end from gene start sites. Virology. 274, 438-449 (2000).
- Lin, W., Wadlington, N. L., Chen, L., Zhuang, X., Brorson, J. R., Kang, U. J. Loss of PINK1 attenuates HIF-1α induction by preventing 4E-BP1-dependent switch in protein translation under hypoxia. J Neurosci. 34 (8), 3079-3089 (2014).
- Martin, I., Kim, J. W., Lee, B. D., Kang, H. C., Xu, J. C., Jia, H. 2., Stankowski, J., et al. Ribosomal protein s15 phosphorylation mediates LRRK2 neurodegeneration in Parkinson’s disease. Cell. 57 (2), 472-485 (2014).
- Cohen, S., Au, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J Vis Exp. (24), (2009).
- Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. (69), e4449 (2012).
- Keiper, B. D., Rhoads, R. E. Translational recruitment of Xenopus maternal mRNAs in response to poly(A) elongation requires initiation factor eIF4G-1. Dev Biol. 206 (1), 1-14 (1999).
- Wakiyama, M., Imataka, H., Sonenberg, N. Interaction of eIF4G with poly(A)-binding protein stimulates translation and is critical for Xenopus.oocyte maturation. Curr Biol. 10 (18), 1147-1150 (2000).
- Sheets, M. D., Wu, M., Wickens, M. Polyadenylation of c-mos mRNA as a control point in Xenopus meiotic maturation. Nature. 374 (6522), 511-516 (1995).
- Gebauer, F., Richter, J. D. Synthesis and function of Mos: the control switch of vertebrate oocyte meiosis. Bioessays. 19 (1), 23-28 (1997).
- Le Sommer, C., Lerivray, H., Lesimple, M., Hardy, S. Xenopus as a model to study alternative splicing in vivo. Biol Cell. 99 (1), 55-65 (2007).
- Au, S., Cohen, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis.oocytes as a system for studying nuclear transport of viruses. Methods. 51 (1), 114-120 (2010).
- Gotoh, T., Villa, L. M., Capelluto, D. G., Finkielstein, C. V. Regulatory pathways coordinating cell cycle progression in early Xenopus development. Results Probl Cell Differ. 53, 171-199 (2011).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
- Moreno, J. A., Halliday, M., Molloy, C., Radford, H., Verity, N., Axten, J. M., et al. Oral treatment targeting the unfolded protein response prevents neurodegeneration and clinical disease in prion-infected mice. Sci Transl Med. 5 (206), 206ra138 (2013).
- Doyle, K. M., Kennedy, D., Gorman, A. M., Gupta, S., et al. Unfolded proteins and endoplasmic reticulum stress in neurodegenerative disorders. J Cell Mol Med. 15 (10), 2025-2039 (2011).
- Gandin, V., Sikström, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), e51455 (2014).
