العزلة والحفظ بالتبريد من الأطفال حديثي الولادة الجرذ العضلية
Summary
The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.
Abstract
Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for α-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.
Introduction
زراعة الخلايا العضلية من هي أداة حاسمة في مجال البحوث القلب الحديث. وتستخدم العضلية الفئران حديثي الولادة (NRCMs) عادة منذ العزلة والثقافة هو أسهل من أن الخلايا العضلية الفئران البالغة 1. طريقة NRCM لا يزال لديه العديد من القيود بما في ذلك إجراء العزل الطويل وتكاثر الخلايا محدود في الطبق. هناك العديد من البروتوكولات لعزل NRCMs مع تتطلب أكثر عموما 4-48 ساعة عمل 2-6. وبالإضافة إلى ذلك، كثيرا ما عزل الخلايا من 1 إلى الفئران الوليدة العمر 2-يوم 2،4-7. توقيت الولادة لا يمكن التنبؤ والصراع مع الأعمال الأخرى في المختبر. يمكن أن العزلة تكون غير فعالة والإسراف إذا كانت هناك حاجة فقط كمية صغيرة من الخلايا لإجراء التجارب. معظم الجهود على تحسين تركيز العمل على الحد من الوقت العزلة، ولكن هذا لا يحل مشاكل توقيت ولادة الجراء.
كبدائل، العديد من المعامل تستخدمالعضلية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) أو الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs). ومع ذلك، يمكن لعملية إعادة برمجة و / أو التمايز يكون وقتا طويلا جدا ومكلفة أيضا. يمكن أن يكون هناك مشاكل أخرى عند استخدام هذه الخلايا كما هو الحال في المختبر نماذج العضلية. وقد تبين أن كلا ESC- وiPSC- العضلية المشتقة لعرض الاختلافات في الكهربية من العضلية الأولية 8-10.
NRCMs فصلها هي قادرة على يجري تخزينها لعدة أيام باستخدام التبريد 11، ولكن هذا لا يسمح للتخزين على المدى الطويل. وعادة ما تستخدم النيتروجين السائل للحفاظ على خلايا لفترة أكبر من الوقت، ولكن يتطلب مثل cryoprotectant كما سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO). وقد أظهرت أبحاث سابقة أن تركيز المثالي بين 5-10٪ DMSO في وسائل الإعلام تجميد يسمح الحفظ بالتبريد من NRCMs، ولكن حتى ذلك الحين جدوى لا يزال منخفضا 12. وعلى الرغم من DMSO يساعد على حماية الخلايا أثناء مجانازينغ، فإنه يمكن أن تكون سامة لخلايا بتركيزات فوق 1.5٪ 13. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن إزالة ببطء DMSO من الخلايا، قد يحسن خلية حيوية 14.
سعينا لتحسين كفاءة المقايسات خلية مقرها NRCM التي كتبها cryopreserving الخلايا التالية العزلة. وهذا يسمح للخلايا ليتم إذابة واستخدامها عند الضرورة، والحد من وتيرة العزلة واستهلاك الحيوانات. باستخدام هذه الطريقة، وتبين لنا أنه من الممكن أن cryopreserve NRCMs وذوبان الجليد من أجل استخدامها في وقت لاحق. بعد ذوبان الحفاظ على الخلايا على البقاء مقبولة وتنتج الثقافات NRCM التي هي ايجابية لل-α الساركومير actinin (α-SA) والعقد من تلقاء أنفسهم.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول يسمح لNRCMs أن تكون معزولة، cryopreserved، وإذابة. ذوبان الخلايا هو جزء حاسم من الإجراء. ويتم استخدام سلسلة من التخفيفات DMSO لإزالة DMSO ببطء من الخلايا 14. من المهم أن استخراج DMSO أن يؤديها بسرعة مثل خلايا حساسة بشكل خاص إلى الموت مباشرة بعد ذوبان الجليد. إذا ه…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by funding from American Heart Association 12BGIA12040477, NC State University Chancellor’s Faculty Excellence Program, and National Natural Science Foundation of China H020381370216.
Materials
| IMDM (+25mM HEPES +L-glutamine) | Gibco | 12440-046 | With added 25mM HEPES and L-glutamine |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| HBSS (+Ca +Mg) | Corning | 21-020-CV | With added calcium and magnesium, pH 7.1-7.4 |
| Trypsin 0.25% | Gibco | 25300-056 | |
| Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | Freezing media |
| Cryogenic Vial | Corning | 430659 | |
| Collagenase | Sigma | C1889-50MG | |
| 40μm Cell Strainer | Greiner Bio-One | 542040 | |
| Sterilizing Vacuum Filter (0.22μm) | Corning | 431118 | |
| 50mL Conical | Corning | 430828 | |
| 15mL Conical | Corning | 430790 | |
| trypan blue | Cellgro | 25-900-CI | |
| Mr Frosty Freezing Container | ThermoScientific | 5100-0001 | |
| Millicell EZ SLIDES | Millipore | PEZGS0416 | |
| α-sarcomeric actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Bromodeoxyuridine | BD Biosciences | 51-7581KZ |
References
- Louch, W. E., Sheehan, K. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Miragoli, M., Salvarani, N., Rohr, S. Myofibroblasts Induce Ectopic Activity in Cardiac Tissue. Circulation Research. 101, 755-758 (2007).
- Simpson, P., Savion, S. Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells. Cross-striations, ultrastructure, and chronotropic response to isoproterenol. Circulation Research. 50 (1), 101-116 (1982).
- Simpson, P., McGrath, a., Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
- Rohr, S., Flückiger-Labrada, R., Kucera, J. P. Photolithographically defined deposition of attachment factors as a versatile method for patterning the growth of different cell types in culture. Pflügers Archive : European Journal of Physiology. 446 (1), 125-132 (2003).
- Zhang, B., Green, J. V., Murthy, S. K., Radisic, M. Label-free enrichment of functional cardiomyocytes using microfluidic deterministic lateral flow displacement. PloS One. 7 (5), e37619 (2012).
- Boateng, S. Y., Hartman, T. J., Ahluwalia, N., Vidula, H., Desai, T. Inhibition of fibroblast proliferation in cardiac myocyte cultures by surface microtopography. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 285 (1), C171-C182 (2003).
- Fu, J. -. D., Li, J., et al. Crucial role of the sarcoplasmic reticulum in the developmental regulation of Ca2+ transients and contraction in cardiomyocytes derived from embryonic stem cells. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (1), 181-183 (2006).
- Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. a Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation. Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).
- Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
- Uchida, T., Nagayama, M., Taira, T., Shimizu, K., Sakai, M., Gohara, K. Optimal temperature range for low-temperature preservation of dissociated neonatal rat cardiomyocytes. Cryobiology. 63 (3), 279-284 (2011).
- Miyamura, K., Nagayama, M., et al. Evaluation of viability of cryopreserved rat cardiac myocytes and effects of dimethyl sulfoxide concentration on cryopreservation. Cryobiology. 59 (3), 375 (2010).
- Rana, P., Anson, B., Engle, S., Will, Y. Characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: bioenergetics and utilization in safety screening. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 130 (1), 117-131 (2012).
- Yokomuro, H., Mickle, D. a. G., Weisel, R. D., Li, R. -. K. Optimal conditions for heart cell cryopreservation for transplantation. Molecular and Cellular Biochemistry. 242 (1-2), 109-114 (2003).
- Simpson, P., McGrath, a., Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
- Evans, H. J., Western Goodwin, R. L. array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development. Molecular and Cellular Biochemistry. 303 (1-2), 189-199 (2007).
- Golden, H. B., Gollapudi, D., et al. Methods in Molecular Biology. , 205-214 (2012).
- Zlochiver, S., Muñoz, V., Vikstrom, K. L., Taffet, S. M., Berenfeld, O., Jalife, J. Electrotonic myofibroblast-to-myocyte coupling increases propensity to reentrant arrhythmias in two-dimensional cardiac monolayers. Biophysical Journal. 95 (9), 4469-4480 (2008).
- Chang, M. G., Zhang, Y., et al. Spiral waves and reentry dynamics in an in vitro model of the healed infarct border zone. Circulation Research. 105 (11), 1062-1071 (2009).
