Isolamento e Crioconservazione di neonatali Rat Cardiomyocytes
Summary
The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.
Abstract
Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for α-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.
Introduction
Coltura cellulare di cardiomiociti è uno strumento fondamentale per la ricerca cardiaca moderna. Cardiomiociti di ratto neonatale (NRCMs) sono comunemente usati poiché l'isolamento e la cultura è più facile di quello di cardiomiociti di ratto adulto 1. Il metodo NRCM ha ancora diverse limitazioni, tra cui una lunga procedura di isolamento e la proliferazione cellulare limitata nel piatto. Ci sono numerosi protocolli per l'isolamento di NRCMs con più generalmente richiedono 4-48 ore di lavoro 2-6. Inoltre, le cellule sono spesso isolate da 1 a 2 giorni cuccioli di ratto vecchio 2,4-7; i tempi della nascita può essere imprevedibile e in conflitto con altri lavori in laboratorio. I isolamenti possono essere inefficiente e dispendioso se solo una piccola quantità di cellule sono necessari per gli esperimenti. La maggior parte degli sforzi per migliorare l'attenzione sul flusso di lavoro riducendo il tempo di isolamento, ma questo non risolve il problema della temporizzazione della nascita dei cuccioli.
Come alternativa, molti laboratori utilizzanocardiomiociti derivati da cellule staminali embrionali (ESC) o di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs). Tuttavia, il processo di riprogrammazione e / o differenziazione può essere molto lungo e costoso pure. Ci possono essere altri problemi quando si utilizzano queste cellule come modelli miociti in vitro. Sia ESC- e iPSC- cardiomiociti derivati hanno dimostrato di esporre le differenze di elettrofisiologia di cardiomiociti primari 8-10.
NRCMs dissociati sono in grado di essere conservato per diversi giorni con refrigerazione 11, ma questo non consente per la conservazione a lungo termine. L'azoto liquido è tipicamente usato per conservare le cellule per un maggiore periodo di tempo, ma richiede un crioprotettore come dimetil solfossido (DMSO). Precedenti ricerche hanno dimostrato che la concentrazione ideale tra il 5-10% DMSO nei media congelamento consente per la crioconservazione di NRCMs, ma anche allora la redditività rimane bassa 12. Sebbene DMSO aiuta a proteggere le cellule durante gratiszing, può essere tossico per le cellule a concentrazioni superiori a 1,5% 13. Studi precedenti hanno dimostrato che la rimozione lentamente DMSO dalle cellule, può migliorare la vitalità cellulare 14.
Abbiamo cercato di migliorare l'efficienza dei saggi cellulari NRCM dai cryopreserving cellule dopo l'isolamento. Questo permette alle cellule di essere scongelati e utilizzati quando necessario, riducendo la frequenza di isolamenti e consumo di animali. Usando questo metodo, si dimostra che è possibile cryopreserve NRCMs e scongelare per uso in un secondo momento. Dopo lo scongelamento le cellule mantengono una redditività accettabile e producono culture NRCM che sono positivi per la α-sarcomerica actinina (α-SA) e del contratto spontaneamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo permette ai NRCMs di essere isolati, crioconservati e scongelati. Scongelamento delle cellule è una parte essenziale del procedimento. Una serie di diluizioni DMSO viene utilizzato per rimuovere lentamente DMSO dalle cellule 14. È importante che l'estrazione di DMSO essere eseguita rapidamente le cellule sono particolarmente sensibili a morire immediatamente dopo lo scongelamento. Se sono richieste celle più o meno per scongelamento, i volumi delle soluzioni DMSO possono essere scalat…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by funding from American Heart Association 12BGIA12040477, NC State University Chancellor’s Faculty Excellence Program, and National Natural Science Foundation of China H020381370216.
Materials
| IMDM (+25mM HEPES +L-glutamine) | Gibco | 12440-046 | With added 25mM HEPES and L-glutamine |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| HBSS (+Ca +Mg) | Corning | 21-020-CV | With added calcium and magnesium, pH 7.1-7.4 |
| Trypsin 0.25% | Gibco | 25300-056 | |
| Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | Freezing media |
| Cryogenic Vial | Corning | 430659 | |
| Collagenase | Sigma | C1889-50MG | |
| 40μm Cell Strainer | Greiner Bio-One | 542040 | |
| Sterilizing Vacuum Filter (0.22μm) | Corning | 431118 | |
| 50mL Conical | Corning | 430828 | |
| 15mL Conical | Corning | 430790 | |
| trypan blue | Cellgro | 25-900-CI | |
| Mr Frosty Freezing Container | ThermoScientific | 5100-0001 | |
| Millicell EZ SLIDES | Millipore | PEZGS0416 | |
| α-sarcomeric actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Bromodeoxyuridine | BD Biosciences | 51-7581KZ |
References
- Louch, W. E., Sheehan, K. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Miragoli, M., Salvarani, N., Rohr, S. Myofibroblasts Induce Ectopic Activity in Cardiac Tissue. Circulation Research. 101, 755-758 (2007).
- Simpson, P., Savion, S. Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells. Cross-striations, ultrastructure, and chronotropic response to isoproterenol. Circulation Research. 50 (1), 101-116 (1982).
- Simpson, P., McGrath, a., Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
- Rohr, S., Flückiger-Labrada, R., Kucera, J. P. Photolithographically defined deposition of attachment factors as a versatile method for patterning the growth of different cell types in culture. Pflügers Archive : European Journal of Physiology. 446 (1), 125-132 (2003).
- Zhang, B., Green, J. V., Murthy, S. K., Radisic, M. Label-free enrichment of functional cardiomyocytes using microfluidic deterministic lateral flow displacement. PloS One. 7 (5), e37619 (2012).
- Boateng, S. Y., Hartman, T. J., Ahluwalia, N., Vidula, H., Desai, T. Inhibition of fibroblast proliferation in cardiac myocyte cultures by surface microtopography. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 285 (1), C171-C182 (2003).
- Fu, J. -. D., Li, J., et al. Crucial role of the sarcoplasmic reticulum in the developmental regulation of Ca2+ transients and contraction in cardiomyocytes derived from embryonic stem cells. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (1), 181-183 (2006).
- Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. a Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation. Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).
- Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
- Uchida, T., Nagayama, M., Taira, T., Shimizu, K., Sakai, M., Gohara, K. Optimal temperature range for low-temperature preservation of dissociated neonatal rat cardiomyocytes. Cryobiology. 63 (3), 279-284 (2011).
- Miyamura, K., Nagayama, M., et al. Evaluation of viability of cryopreserved rat cardiac myocytes and effects of dimethyl sulfoxide concentration on cryopreservation. Cryobiology. 59 (3), 375 (2010).
- Rana, P., Anson, B., Engle, S., Will, Y. Characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: bioenergetics and utilization in safety screening. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 130 (1), 117-131 (2012).
- Yokomuro, H., Mickle, D. a. G., Weisel, R. D., Li, R. -. K. Optimal conditions for heart cell cryopreservation for transplantation. Molecular and Cellular Biochemistry. 242 (1-2), 109-114 (2003).
- Simpson, P., McGrath, a., Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
- Evans, H. J., Western Goodwin, R. L. array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development. Molecular and Cellular Biochemistry. 303 (1-2), 189-199 (2007).
- Golden, H. B., Gollapudi, D., et al. Methods in Molecular Biology. , 205-214 (2012).
- Zlochiver, S., Muñoz, V., Vikstrom, K. L., Taffet, S. M., Berenfeld, O., Jalife, J. Electrotonic myofibroblast-to-myocyte coupling increases propensity to reentrant arrhythmias in two-dimensional cardiac monolayers. Biophysical Journal. 95 (9), 4469-4480 (2008).
- Chang, M. G., Zhang, Y., et al. Spiral waves and reentry dynamics in an in vitro model of the healed infarct border zone. Circulation Research. 105 (11), 1062-1071 (2009).
