Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.
في الفقاريات، وينظم تكون الدم عن طريق microenvironments الاستقرائي (منافذ). وبالمثل، في نموذج اللافقاريات كائن ذبابة الفاكهة السوداء البطن، وقد تم تحديد microenvironments الاستقرائي المعروفة باسم جيوب المكونة للدم اليرقات (هبس) كمواقع التشريحية لتطوير وتنظيم خلايا الدم (hemocytes)، ولا سيما من سلالة بلعم تجديد الذات. هبس هي كرر segmentally جيوب بين البشرة وطبقات العضلات اليرقة، التي تضم أيضا الخلايا العصبية الحسية في الجهاز العصبي المحيطي. في اليرقة، يتعرضون المقيمين (لاطئة) hemocytes لمكافحة أفكارك لاصقة والعظة التكاثري من هذه الخلايا العصبية الحسية وعناصر محتملة أخرى للهبس، مثل العضلات وطبقات البطانة الظهارية. خلال التطور الطبيعي، الإفراج التدريجي عن hemocytes المقيمين من الوقود هبس سكان hemocytes المتداولة، الذي يبلغ ذروته في الإفراج عن موالحادي من hemocytes المقيمين في بداية التحول. الاعتداءات المناعة والإصابة البدنية أو اضطراب الميكانيكية تؤدي الى الافراز السابق لأوانه hemocytes المقيمين في التداول. التحول من hemocytes اليرقات بين المواقع المقيمين والدورة الدموية يزيد من الحاجة إلى معيار مشترك / إجراءات لعزل انتقائي وتحديد هذين الشعبين من خلايا الدم من يرقات ذبابة الفاكهة واحدة. وفقا لذلك، ويصف هذا البروتوكول وسيلة الآلي لاطلاق سراح وتحديد المقيمين وhemocytes تعميم من اليرقات واحدة. طريقة يسهل النهج خارج الحي، ويمكن تكييفه لخدمة مجموعة متنوعة من مراحل تطور ذبابة الفاكهة والكائنات اللافقارية الأخرى.
وقد أدى البحث في نموذج اللافقاريات ذبابة الفاكهة السوداء البطن اكتشاف المناعة الفطرية 1، وسهلت فهم مختلف جوانب التنمية خلايا الدم ويمكن تقسيم 2-4. تكون الدم ذبابة الفاكهة في نسب hemocytes الجنينية / اليرقات، التي تنشأ في الجنين والتوسع في يرقة، وسلالته من الغدة الليمفاوية hemocytes 4،5. هنا، نقدم البروتوكول الذي يركز على نسب hemocytes الجنينية / اليرقات، التي تضم في يرقة ذبابة الفاكهة بشكل رئيسي plasmatocytes (الضامة) وخلايا الكريستال القليلة 4. في اليرقة، hemocytes الجنين لا تزال قائمة واستعمار المتكررة segmentally ومحطة جيوب المكونة للدم (هبس) الواقعة بين البشرة وطبقات العضلات من جدار الجسم اليرقات 5،6. بناء على طبيعتها كما الضامة تجديد الذات 6 إقامتهم السائدة في microenvironments الأنسجة المحلية 6و 7 و نسبهم من أقرب خلايا الدم الناشئة خلال التنمية 6،8، وتعتبر هذه الفئة من السكان خلايا الدم مماثلة لأنسجة الضامة الفقارية تجديد الذات، وهي النسب التي تم تحديدها مؤخرا النخاعي مستقل في مجموعة متنوعة من الأنواع 4،9،10. ومع ذلك، في ذبابة الفاكهة، بعض أو كل هذه الخلايا المقيمة تظهر أيضا مرونة لتؤدي إلى أنواع خلايا الدم الأخرى مثل خلايا الكريستال 11،12.
hemocytes اليرقات هي في الغالب المقيمين (اطئة)، ولكن في حالة ثابتة دينامية بين مختلف هبس. يتم اطلاق سراحهم تدريجيا في التداول، ولا سيما مع اقتراب 3 يرقة طور مرحلي الثالثة pupariation 5-7. التحديات المناعة أو الإصابة أو الميكانيكية الرصاص اضطراب سابق لأوانه، في الحالة الأخيرة عكسها، وتعبئة hemocytes المقيمين في الدملمف 4،6،13.
واشارت دراسات سابقة أن المقيمين وتداولهاhemocytes اليرقات هي من نفس النسب، ولكنها تختلف في لاصق أو صاروخ موجه ممتلكاتهم 6،7،13،14. العزلة انتقائية تعميم مقابل hemocytes المقيمين كشفت مستويات مرتفعة من انتشار بين السكان كرية دموية المقيمين، مما يشير إلى تعرضهم للمنبهات الاستقرائي من هبس اليرقات هبس 6. ذبابة الفاكهة تصطف من قبل البشرة وطبقات العضلات وزيادة تأوي مجموعات الخلايا العصبية الحسية من الجهاز العصبي المحيطي (السندات الإذنية) وظيفة الكبد تشبه oenocytes 6. وظيفيا، وقد أثبتت التجارب الاجتثاث خلية متحولة وراثية أن الخلايا العصبية الحسية الموجودة في هبس تدعم بقاء الغذائي وتوطين hemocytes اليرقات 6.
نحن هنا تصف طريقة لعزل محددة وتقدير من المقيمين وتعميم hemocytes من يرقات ذبابة الفاكهة واحدة، وبروتوكول للتعبئة كرية دموية الميكانيكية. أساليب يمكن استخدامها لخارج الجسم الحيدراسة hemocytes ويمكن أيضا أن تتكيف مع مراحل تطور ذبابة الفاكهة الأخرى مثل خادرة والكبار، وأنظمة اللافقارية الأخرى. منذ دراسات سابقة لم تفرق بين المقيمين وhemocytes المتداولة، ويوفر هذا البروتوكول معيارا مشتركا لدراسة خلايا الدم المقيمين وسوف تساعد على زيادة الاتساق في أبحاث الخلايا الدموية اللافقاريات.
أولا، يصف كرية دموية التسييل / كشط الفحص العزلة الفرق النوعي والكمي الآلي من الفلورسنت المقيمين بعلامات البروتين وتعميم السكان كرية دموية من يرقات ذبابة الفاكهة واحدة؛ وينص البروتوكول خيارين لالمجاهر العادية والبلاط مجهزة المسح الضوئي (الشكل 1). ونتيجة لذلك، يتم الحصول على نسبة من hemocytes المتداولة وعدد من hemocytes في يرقة. ويعتمد هذا الأسلوب على يرقات ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتين فلوري بين خلايا دمهمعدد السكان. اختيار السائق كرية دموية أو مراسل يحدد النتيجة، أي التي تصور السكان من خلايا الدم وكميا. لتسمية أساسا الضامة (plasmatocytes)، والتي تتكون من الغالبية العظمى من المقيمين وتعميم السكان كرية دموية لليرقة ذبابة الفاكهة 6، وتشمل الجينات المحورة مناسبة HML Δ-DsRed 6، HmlΔ -GAL4 15، PXN -GAL4 16، CRQ-GAL4 (من قبل H. Agaisse 16)، أو آكلى لحوم البشر-GAL4 17؛ لوصفها السكان قليل نسبيا من الخلايا وضوح الشمس، وخطوط مناسبة هي BcF6-CFP و-GFP 18، أو LZ-GAL4 (من قبل J. بولوك 19)؛ لlamellocytes وضع العلامات، ونوع من الخلايا المتخصصة التي يسببها أساسا من التحديات وإصابة 13 المناعية، على سبيل المثال، MSNF9mo-mCherry يمكن استخدامها 17. يتم التعبير عن بعض السائقين المعدلة وراثيا في مجموعة واسعة من الدم متباينةالخلايا والأسلاف، مثل و- GAL4 20، التي تصف حوالي 80٪ من مجموع خلايا الدم اليرقات 20. يرجى ملاحظة أنه في جميع الحالات التي تستخدم فيها السائقين GAL4، مطلوب بالاشتراك مع UAS-GFP أو آخر البروتين الفلوري UAS-التحوير. في قسم النتائج، ويستخدم هذا الأسلوب لمراقبة عدد خلايا الدم وسلوك التداول على مدى نمو اليرقات.
ثانيا، يصف كرية دموية اضطراب الفحص خطوة السابقة تهدف إلى فصل hemocytes المقيمين عن طريق التلاعب الخارجي، والذي يسمح لاحقا تقييم قدرة hemocytes لإعادة تلتزم وموطن هبس ضمن إطار زمني محدود (30-60 دقيقة) 6. وعادة ما يتبع هذا الاختبار من قبل التسييل / كشط الفحص لتحديد نسبة تعميم hemocytes في يرقة. نقدم بروتوكول مبسط لهذا الاختبار (الشكل 1D)، والذي يستخدم اضطراب من قبل vortexing الطرافةحبات ح الزجاج، وبدلا من التلاعب يرقة واحدة مع فرشاة الطلاء كما هو موضح سابقا 6. في قسم النتائج، ويستخدم هذا الاختبار لإثبات أن تطفو hemocytes فصل عابر في الدملمف ويمكن استردادها في جزء من تعميم hemocytes. الفحص مفيد أيضا لتحديد الاختلافات في hemocytes في هم صاروخ موجه / التصاق إلى مواقع المقيمين، مقارنة على سبيل المثال، العديد من خلفيات وراثية أو شروط التحفيز. يرجى ملاحظة أن هذا التلاعب الميكانيكية يعكس عملية عكسها ويختلف عن infection- أو الناجم عن الإصابة تعبئة كرية دموية المقيمين، التي عادة ما تكون ليس عكسها في فترة زمنية قصيرة 4،13.
هنا، نحن تصف الطريقة الأولى لاستعادة الكمية خلايا الدم المقيمين وتعميم من يرقات ذبابة الفاكهة واحدة، وتحديد هؤلاء السكان كرية دموية اثنين. ويضم البروتوكول الإفراج متتابعة من تعميم والمقيمين خلايا الدم، تليها التصوير والعد الآلي خلية. hemocytes المقيمين اليرقات يمكن تعبئتها عابر للتداول من قبل اضطراب الميكانيكية، وهي العملية التي من المعروف أن عكس إلى حد كبير في غضون 30-60 دقيقة فترة النقاهة 6. وبناء على ذلك، تم اختبار هذا البروتوكول بطريقتين، (1) عن طريق تقييم عدد كرية دموية الإجمالي لكل يرقة وجزء من تعميم hemocytes على مدى نمو اليرقات، و (2) من خلال طرد تجريبيا hemocytes المقيمين باستخدام أسلوب الآلي، والتي أكدت ارتباط ضيق التوطين كرية دموية وعدد كرية دموية في السكان المقيمين والمنتشرة. بالإضافة إلى ذلك، وقد تجلى استنساخ طريقة التي شاركmparing مجموعتين من البيانات من مكررات البيولوجية.
في الماضي، استخدمت المختبرات مجموعة من التقنيات لقياس hemocytes اليرقات 6،13،21. هذا البروتوكول يحدد معيارا مشتركا لاسترداد وتحديد السكان خلايا الدم المقيمين وتعميم من يرقات ذبابة الفاكهة، وتوفير منصة للتكيف بسهولة. الطريقة الموصوفة أمر بالغ الأهمية للدراسات التي تركز على دور hemocytes المقيمين والمكروية بهم، والمكونة للدم جيوب 4-6، ومناسبة لدراسة ببروتين التي تحمل التحوير سلالات ذبابة الفاكهة في النوع البري والخلفيات المعدلة وراثيا. البروتوكول هو أيضا ذات الصلة للدراسات التي تركز على تعبئة كرية دموية بعد التحدي المناعة أو الإصابة، والإشارات التي يسببها وراثيا أو بيئيا الذي يقوم بتشغيل تعبئة hemocytes المقيمين أو التغيرات في مجموع عدد كرية دموية (إعادة النظر في 4). وتجدر الإشارة إلى أنه في حالات دي سابق لأوانهfferentiation والإفراج عن hemocytes من الغدة الليمفاوية، مع التمييز الجنينية / اليرقات مقابل الأنساب الغدة الليمفاوية قد تكون محدودة بسبب نمط التعبير لمراسل كرية دموية الفلورية المستخدمة.
بروتوكول المعروضة هنا يعتمد على العيش التصوير، hemocytes fluorescently المسمى. في المستقبل، يمكن تعديله للسماح للكشف عن الخلايا أفرج عنه بعد التثبيت، على سبيل المثال، وذلك باستخدام مناعية. في هذه الحالة، قد يحتاج البروتوكول يمكن تكييفها لضمان التصاق كاملة من خلايا الدم، على سبيل المثال عن طريق زيادة مرات التصاق الحضانة، وإضافة طلاء لاصق الشريحة، مثل كونكانافالين A. منذ الأسلوب يسمح استرجاع hemocytes والسابقين التلاعب بها الجسم الحي، وسوف تستفيد مجموعة واسعة من الدراسات البيولوجية والبيوكيميائية التنموية، الخلية. تم العثور على خلايا المقيمين وتعميم الدم أثناء جميع مراحل تال للمرحلة الجنينية التنموية من ذبابة الفاكهة وغيرها من اللافقاريات 22، suggestiنانوغرام أن تكيف هذه الطريقة سوف تستفيد مجموعة واسعة من الدراسات ما بعد نظام المكونة للدم اليرقات ذبابة الفاكهة.
The authors have nothing to disclose.
نشكر يسبر Kronhamn ودان Hultmark، مايكل Galko، ومركز بلومنغتون المالية للأسهم الطاير. شكر خاص إلى كورتني اونوديرا للحصول على المشورة مع التحليل الإحصائي. نشكر كاترينا الذهب لقراءة نقدية للمخطوطة، وكالبانا ماخيجاني، كاترينا الذهب، وأعضاء المختبر Derynck، وأعضاء المختبر Nystul للمناقشة والتعليقات على المخطوطة. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من برنامج UCSF للبحوث الطبية الحيوية اختراق (PBBR)، مركز اسع، مؤسسة هيلمان، جمعية السرطان الأمريكية RSG DDC-122595، جمعية القلب الأمريكية 13BGIA13730001، المؤسسة الوطنية للعلوم 1326268، المعاهد الوطنية للصحة و1R01GM112083-01 1R56HL118726-01A1 (لKB).
6cm/9cm Petri dishes | One for each genotype to be evaluated | ||
Water squirt bottle | |||
Metal spoon/spatula | |||
Thin paintbrush | e.g. a "liner" | ||
Glass cavity dish | |||
PAP pen: Super PAP PEN IM3580 | Beckman Coulter | ||
Glass slides | Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; e.g. 2mm squares. | ||
Moist chamber | This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom | ||
Schneider’s Drosophila cell culture media | Invitrogen | ||
Cold block | This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color | ||
Two 1ml syringes with needles (27G ½) | Becton Dickinson | For dissections. | |
Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2mm) | Fine Science Tools | ||
Glass beads, 212-600 micron | Sigma | ||
2 ml Eppendorf tubes | Eppendorf | One per genotype evaluating | |
Vortex Mixer | Fisher Scientific | ||
Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes. Suitable transgenes include: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski et al., 2007), or HmlΔ-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes. | |||
Fluorescence dissecting microscope | Leica | Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module | |
Inverted fluorescence microscope with camera attachment | Leica or Keyence | With or without tile scanning function (eg. Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series) |