की परख ब्लड सेल आबादी<em> ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em> लार्वा

Summary

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Abstract

रीढ़ में, hematopoiesis प्रेरक microenvironments (आलों) द्वारा नियंत्रित किया जाता है। इसी तरह, अकशेरुकी मॉडल जीव ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में, लार्वा Hematopoietic जेबें (एचपीएस) के रूप में जाना प्रेरक microenvironments स्वयं renewing बृहतभक्षककोशिका वंश का विशेष रूप से विकास और रक्त कोशिकाओं (hemocytes) के विनियमन के लिए संरचनात्मक साइटों, के रूप में पहचान की गई है। HPs हैं segmentally भी परिधीय तंत्रिका तंत्र के संवेदी न्यूरॉन्स शामिल है जो लार्वा की एपिडर्मिस और मांसपेशियों की परतों के बीच जेब दोहराया। लार्वा में, निवासी (डंठल) hemocytes विरोधी apoptotic, चिपकने वाला और इन संवेदी न्यूरॉन्स से proliferative संकेतों और इस तरह के अस्तर मांसपेशियों और उपकला परतों के रूप में HPS के संभावित अन्य घटकों के संपर्क में हैं। HPs ईंधन से सामान्य विकास, निवासी hemocytes की क्रमिक रिहाई के दौरान मो की रिहाई में खत्म जो घूम hemocytes की जनसंख्याकायापलट की शुरुआत में निवासी hemocytes की ST। इम्यून हमले, शारीरिक चोट या यांत्रिक गड़बड़ी के संचलन में निवासी hemocytes की समय से पहले रिहाई को ट्रिगर। निवासी स्थानों और संचलन के बीच लार्वा hemocytes के स्विच चुनिंदा अलग करने और एकल ड्रोसोफिला लार्वा से रक्त कोशिकाओं के इन दो आबादी यों की एक आम मानक / प्रक्रिया के लिए की जरूरत को उठाती है। तदनुसार, इस प्रोटोकॉल जारी है और एकल लार्वा से निवासी और घूम hemocytes यों के लिए एक स्वचालित विधि का वर्णन है। विधि पूर्व vivo दृष्टिकोण की सुविधा है, और ड्रोसोफिला के विकास के चरणों और अन्य अकशेरुकी जीवों की एक किस्म की सेवा करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

अकशेरुकी मॉडल ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में अनुसंधान सहज उन्मुक्ति ¹ की खोज के लिए प्रेरित किया है, और ^2-4। ड्रोसोफिला hematopoiesis में आरंभ जो भ्रूण / लार्वा hemocytes के वंश में विभाजित किया जा सकता है, रक्त कोशिका विकास के विभिन्न पहलुओं की समझ में मदद की है भ्रूण और लार्वा में विस्तार, और लसीका ग्रंथि के वंश ^4,5 hemocytes। यहाँ, हम ड्रोसोफिला लार्वा में मुख्य रूप से plasmatocytes (मैक्रोफेज) और कुछ क्रिस्टल कोशिकाओं ⁴ शामिल हैं जो लार्वा / भ्रूण hemocytes के वंश, पर केंद्रित है कि एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। एपिडर्मिस और लार्वा शरीर दीवार ^5,6 की मांसपेशियों की परतों के बीच स्थित लार्वा में, भ्रूण के hemocytes जारी रहती है और उपनिवेश segmentally दोहराया और टर्मिनल Hematopoietic जेबें (एचपीएस)। स्वयं renewing मैक्रोफेज ^6, स्थानीय ऊतक microenvironments ⁶ में उनकी प्रमुख निवास के रूप में उनकी प्रकृति के आधार पर, विकास ^6.8 दौरान उभरते जल्द से जल्द रक्त कोशिकाओं से 7, और उनके वंश, यह रक्त कोशिका आबादी कशेरुकी स्वयं renewing ऊतक मैक्रोफेज, हाल ही में प्रजातियों ^4,9,10 की एक किस्म में पहचान एक स्वतंत्र माइलॉयड वंश के समान माना जाता है। हालांकि, ड्रोसोफिला में, कुछ या इन निवासी कोशिकाओं के सभी भी प्लास्टिसिटी ऐसे क्रिस्टल कोशिकाओं ^11,12 के रूप में अन्य रक्त प्रकार की कोशिकाओं को जन्म देने के लिए दिखा।

लार्वा hemocytes मुख्य रूप से निवासी (डंठल) कर रहे हैं, लेकिन विभिन्न HPs के बीच एक गतिशील स्थिर राज्य में हैं। ³ instar लार्वा pupariation ^5-7 दृष्टिकोण के रूप में वे उत्तरोत्तर विशेष रूप से, संचलन में जारी किए हैं। Hemolymph ^4,6,13 में इम्यून प्रतिवर्ती उत्तरार्द्ध मामले में चुनौतियों, समय से पहले करने के लिए चोट या यांत्रिक गड़बड़ी के नेतृत्व, निवासी hemocytes की लामबंदी।

पिछले अध्ययनों कि निवासी सुझाव दिया है और घूम चुके हैंलार्वा hemocytes इसी वंश के हैं, लेकिन उनके चिपकने वाला या घर वापस आना गुण ^6,7,13,14 में मतभेद है। निवासी hemocytes बनाम घूम के चुनिंदा अलगाव परिधीय तंत्रिका तंत्र के संवेदी न्यूरॉन समूहों एपिडर्मिस और मांसपेशियों की परतों से लाइन में खड़ा है और आगे बंदरगाह रहे हैं HPs ^6। ड्रोसोफिला लार्वा HPs से प्रेरक संकेतों के लिए अपने जोखिम, सुझाव निवासी hemocyte आबादी में प्रसार का ऊंचा स्तर का पता चला (पीएन) और जिगर समारोह oenocytes ⁶ जैसी। कार्यात्मक, उत्परिवर्ती और आनुवंशिक सेल पृथक प्रयोगों HPs में मौजूद संवेदी न्यूरॉन्स लार्वा hemocytes ⁶ की पौष्टिकता अस्तित्व और स्थानीयकरण का समर्थन करने वाले प्रदर्शन किया है।

यहाँ हम विशिष्ट अलगाव और निवासी की मात्रा का ठहराव और एकल ड्रोसोफिला लार्वा से घूम hemocytes, और यांत्रिक hemocyte जुटाने के लिए एक प्रोटोकॉल के लिए एक विधि का वर्णन है। तरीकों पूर्व vivo के लिए इस्तेमाल किया जा सकताhemocytes के अध्ययन और आगे इस तरह के प्यूपा और वयस्क, और अन्य अकशेरुकी सिस्टम के रूप में अन्य ड्रोसोफिला विकास के चरणों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। पिछले अध्ययनों निवासी और घूम hemocytes के बीच भेद नहीं था, इस प्रोटोकॉल निवासी रक्त कोशिकाओं के अध्ययन के लिए एक आम मानक प्रदान करता है और अकशेरुकी रक्त कोशिका अनुसंधान की स्थिरता बढ़ाने में मदद मिलेगी।

सबसे पहले, hemocyte भरो / परिमार्जन परख अंतर अलगाव और फ्लोरोसेंट प्रोटीन चिह्नित निवासी और एकल ड्रोसोफिला लार्वा से hemocyte आबादी घूम के स्वचालित मात्रा का ठहराव का वर्णन करता है; प्रोटोकॉल नियमित रूप से और टाइल स्कैन सुसज्जित सूक्ष्मदर्शी के लिए दो विकल्प (चित्रा 1) प्रदान करता है। नतीजतन, घूम hemocytes का प्रतिशत और लार्वा प्रति hemocytes की कुल संख्या प्राप्त कर रहे हैं। विधि उनके रक्त कोशिका के बीच फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कि ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला लार्वा पर ​​निर्भर करता हैआबादी। hemocyte ड्राइवर या रिपोर्टर के चुनाव रक्त कोशिकाओं की आबादी कल्पना और मात्रा निर्धारित है जो, यानी, परिणाम को निर्धारित करता है। मुख्य रूप से लेबल करने के लिए मैक्रोफेज निवासी और ड्रोसोफिला लार्वा ⁶ की घूम hemocyte आबादी के विशाल बहुमत शामिल है, जो (plasmatocytes), उपयुक्त ट्रांसजीन (द्वारा HML Δ-DsRed ^6, HmlΔ -GAL4 ^15, PXN -GAL4 ^16, Crq-Gal4 शामिल एच Agaisse ^16), या भक्षक-Gal4 ^17; क्रिस्टल कोशिकाओं की अपेक्षाकृत छोटी आबादी लेबलिंग के लिए, उपयुक्त लाइनों BcF6-सीएफपी और -GFP ^18, या (जे पोलक ¹⁹ से) LZ-GAL4 हैं, लेबलिंग lamellocytes के लिए एक विशेष सेल प्रकार मुख्य रूप से प्रतिरक्षा चुनौतियों और चोट ¹³ से प्रेरित, जैसे, MSNF9mo-mCherry ¹⁷ में इस्तेमाल किया जा सकता है। कुछ ट्रांसजेनिक ड्राइवरों विभेदित रक्त की एक श्रेणी में व्यक्त कर रहे हैंसभी लार्वा रक्त कोशिकाओं को ²⁰ के बारे में 80% लेबल जो GAL4 ^20, – जैसे वह के रूप में कोशिकाओं और पूर्वज,। GAL4 ड्राइवरों का इस्तेमाल किया जाता है, जहां यूएएस GFP या अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन यूएएस ट्रांस्जीन के साथ संयोजन की आवश्यकता है, सभी मामलों में है कि कृपया ध्यान दें। परिणाम अनुभाग में, इस विधि लार्वा विकास के पाठ्यक्रम पर रक्त कोशिका संख्या और परिसंचरण व्यवहार पर नजर रखने के लिए प्रयोग किया जाता है।

(- 60 मिनट 30) ⁶ दूसरा, hemocyte अशांति परख बाद में फिर से पालन करने के लिए और घर HPS करने की एक सीमित समय सीमा के भीतर hemocytes की क्षमता के मूल्यांकन की अनुमति देता है जो बाहरी हेरफेर, द्वारा निवासी hemocytes अलग करने के लिए बनाया गया एक पिछले चरण का वर्णन है। आम तौर पर यह परख लार्वा प्रति hemocytes घूम का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए भरो / परिमार्जन परख के बाद है। हम vortexing बुद्धि से अशांति का उपयोग करता है, जो इस परख (चित्रा -1), के लिए एक सरल प्रोटोकॉल प्रस्तुतज कांच के मोती, बजाय एक पेंट ब्रश के साथ एकल लार्वा के हेरफेर के पहले ⁶ वर्णित है। परिणाम अनुभाग में, इस परख hemolymph में है कि क्षणिक अलग hemocytes नाव प्रदर्शित करने के लिए प्रयोग किया जाता है और hemocytes घूम के अंश में बरामद किया जा सकता है। परख जैसे, विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि या उत्तेजना की स्थिति की तुलना निवासी साइटों के लिए अपनी घर वापस आना / आसंजन में hemocytes के मतभेद, जिसका अंदाजा लगाना भी उपयोगी है। इस यांत्रिक हेरफेर एक प्रतिवर्ती प्रक्रिया को दर्शाता है और आम तौर पर एक छोटी समय सीमा ^4,13 में प्रतिवर्ती नहीं कर रहे हैं, जो infection- या चोट प्रेरित निवासी hemocyte जुटाना, से अलग है कि कृपया ध्यान दें।

Protocol

1. hemocyte भरो / परिमार्जन परख स्लाइड्स की तैयारी: टाइल स्कैनिंग समारोह के बिना माइक्रोस्कोप के लिए विकल्प 1: प्रत्येक लार्वा का विश्लेषण करने के लिए, माइक्रोस्कोप के क्षेत्र क्षेत्र को देखने के लिए इसी 2 मिमी चौकों प्रत्येक के बारे में 5 पैप-कलम कुओं के साथ एक गिलास स्लाइड तैयार; प्रत्येक (चित्रा 1 ए) के लिए S2 मीडिया के 10 μl – लगभग 5 जोड़ें। बाहर सुखाने से कुओं को रोकने के लिए नम कक्ष में स्लाइड रखें। टाइल स्कैनिंग समारोह के साथ सूक्ष्मदर्शी के लिए विकल्प 2: प्रत्येक लार्वा का विश्लेषण करने के लिए, ~ 3 के 3 से 4 पैप-कलम कुओं के साथ एक गिलास स्लाइड तैयार – 4 मिमी चौकों प्रत्येक; प्रत्येक अच्छी तरह से (चित्रा 1 बी) के एस 2 मीडिया के 20 μl – लगभग 15 जोड़ें। बाहर सुखाने से कुओं को रोकने के लिए नम कक्ष में स्लाइड रखें। नोट: कुओं के ऊपर सिफारिश की संख्या ~ 2.5, लार्वा के लिए प्रति 3,000 hemocytes का योग (देर से 2 एन डी instar लार्वा के लिए पर्याप्त है – larv के बहुमत लेबलिंग 3 मिमी लंबाई, ट्रांस्जीनअल रक्त कोशिकाओं)। बड़ा रक्त कोशिकाओं की संख्या का आकलन करते हैं, अधिक कुओं अधिक भीड़ से बचने के लिए आवश्यक हो सकता है। लार्वा का संग्रह: एक पेट्री डिश में लार्वा और फ्लश लार्वा युक्त एक मक्खी शीशी में पानी धार, या एक पेट्री डिश में लार्वा होता है कि कुछ खाद्य स्कूप और एक धार की बोतल का उपयोग कर पानी के साथ पतला। धीरे एक तूलिका का उपयोग पेट्री डिश के बाहर लार्वा उठाओ और एक गुहा डिश में या सर्दी खंड पर एक स्लाइड पर पानी में उन्हें जगह है। नोट: लार्वा पानी में या सर्दी खंड पर एक सीमित समय के लिए रखा जा सकता है; लार्वा मौत या hemocytes पर अवांछित प्रभाव से बचने के लिए 45 मिनट या उससे कम समय के भीतर नमूनों का उपयोग करें। विच्छेदन: एक ठंडा धातु खंड पर एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे लार्वा का चयन करें। अगर वांछित आकार और छवि लार्वा को मापने। ("खून") hemocytes घूम का अलगाव: लार्वा चयनित हो जाने के बाद, पहली बार पैप-कलम अच्छी तरह से (चित्रा 1C में एक लार्वा जगह2A)। लार्वा के पीछे और पूर्वकाल दोनों सिरों पर एक चीरा बनाने के लिए 2 स्वच्छ सुई या विदारक कैंची और संदंश का प्रयोग करें। निवासी hemocytes परेशान करने से बचने के लिए, यह लार्वा के उदर पक्ष पर इन चीरों बनाने के लिए सबसे अच्छा है। अनुरूप परिणाम के लिए, हर लार्वा के लिए एक ही स्थानों में चीरों बनाते हैं। 1 सेंट instar लार्वा के लिए, (उदर पूर्वकाल में) एक चीरा पर्याप्त है। लार्वा किसी दबाव या शारीरिक आंदोलन (2A चित्रा) के बिना कुछ सेकंड के लिए खून बहाना करने की अनुमति दें। नोट: कई लार्वा पर काम कर रहे हैं, तो यह नमूने 'अखंडता को प्रभावित कर सकता है जो बहुत लंबा बर्फ पर लार्वा रखने से बचने के लिए अगले चरण के लिए आगे बढ़ने से पहले हर एक के लिए इन चीरों बनाने के लिए बेहतर है। धीरे सुई या संदंश के साथ लार्वा उठा और किसी भी शेष घूम hemocytes कुल्ला करने के लिए दूसरे कुएँ में डुबकी। उसके बाद, निवासी hemocytes के रिलीज के साथ पालन करें। <lमैं> निवासी hemocytes का अलगाव ("परिमार्जन"): धीरे अगले अच्छी तरह से (चित्रा -2) के लिए लार्वा हस्तांतरण। आम तौर पर लार्वा के पूर्वकाल अंत से लगभग 1/3 स्थित है, जो लार्वा के लसीका ग्रंथि को पहचानें, और लार्वा शरीर दीवार के माध्यम से पीछे की ओर, जो प्रतिदीप्ति सकता है। (चित्रा -2) puncturing से बचने के लिए लसीका ग्रंथि के रूप में पास हो सके एक सुई के साथ लार्वा नीचे लगाए द्वारा निवासी hemocytes जारी करते हुए लसीका ग्रंथि से बचें। नोट: लसीका ग्रंथि hemocytes की परिपक्वता लार्वा hemocytes की तुलना में देरी हो रही है, और विभेदित hemocytes की फ्लोरोसेंट संवाददाताओं युवा लार्वा की लसीका ग्रंथि में एक संकेत नहीं दिखा सकते हैं सामान्य विकास के दौरान। इन उदाहरणों में, कम ध्यान उम्मीद है लसीका ग्रंथि hemocytes से भेदभाव fluorescently लेबल लार्वा hemocytes की कोई संदूषण के रूप में लसीका ग्रंथि के लिए भुगतान करने की जरूरत है। एक dissecti में निवासी रक्त कोशिकाओं को रिलीजस्क्रैप और / या jabbing की प्रक्रिया पर। जरूरत के रूप में प्रभावी ढंग से लसीका ग्रंथि के पास लार्वा (ऊपर देखें) या शरीर के अन्य क्षेत्रों के लिए नीचे पिन एक लैस का प्रयोग करें। Hemocytes अलग करने के लिए लक्ष्य है, लार्वा शरीर दीवार (चित्रा -2 सी, ई) के माध्यम से दिखाई दे रहे हैं कि hemocytes के समूहों पर प्रहार करने के लिए एक और सुई का प्रयोग करें। Hemocytes भी एक स्क्रैप गति में जारी किया जा सकता। हालांकि, जल्दी एपिडर्मिस फाड़ स्वचालित गिनती अधिक चुनौतीपूर्ण बना सकता है जो रक्त कोशिकाओं के बड़े समूहों जारी कर सकते हैं। नोट: लार्वा की उम्र और जीनोटाइप पर निर्भर करता है, कुल hemocytes की संख्या अलग-अलग होगा। एकल कोशिका छवि विश्लेषण और अधिक कठिन बना सकता है जो रक्त कोशिकाओं के साथ कुछ कुओं की भीड़भाड़ से बचने के लिए कई कुओं से अधिक ऊपर वर्णित रिहाई प्रक्रिया बांटो। कुछ hemocytes अंतिम शव में रहते हैं, एक मैनुअल मिलान काउंटर (चित्रा 2 ई) की खुर्दबीन और प्रयोग के माध्यम से अवलोकन द्वारा इन hemocytes गिनती। गिनती, पी की सुविधा के लिएएक ही स्लाइड की एक साफ क्षेत्र पर शव फीता और ऑप्टिकल विमानों की संख्या को कम करने के रूप में बारीकी से संभव के रूप में यह फैल गया। कोशिकाओं कुओं इमेजिंग से पहले बसने (लेकिन जरूरी पालन नहीं) के लिए 10 मिनट – विच्छेदन पूरा हो जाने पर, 5 के बीच प्रतीक्षा करें। सूखने से बचने के लिए एक नम कक्ष में स्लाइड सेते हैं, और बसे hemocytes को परेशान कर सकता है, जो स्लाइड्स, की किसी न किसी तरह से निपटने से बचें। नोट: निर्धारित hemocyte मायने रखता है, जारी कोशिकाओं तय नहीं कर रहे हैं और कोशिकाओं अधिमानतः लार्वा से रिहा होने के बाद 30 मिनट के भीतर, शीघ्र ही विच्छेदन के बाद imaged किया जाना चाहिए। कुएं में मध्यम से ऑप्टिकल विमानों के माध्यम से ध्यान केंद्रित द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए, जो 10 मिनट, – मध्यम और सेल गुणों की मात्रा पर निर्भर करता है, कोशिकाओं के विशाल बहुमत के 5 भीतर बसे हैं जाएगा। हालांकि, रक्त कोशिकाओं का एक अंश ही, इस समय तक स्लाइड सतह के लिए विचार किया जाना चाहिए कि एक तथ्य पालन किया जाएगा अगर सेल निर्धारण आधारित Approache के लिए इस प्रोटोकॉल को संशोधितएस। मात्रा का ठहराव: एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (चित्रा 2 बी, डी, एफ) के तहत बसे hemocytes की छवियों को ले लो। ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग hemocytes की मात्रा का ठहराव के साथ पालन करें। ImageJ सेल गिनती एल्गोरिथ्म के लिए छवि तैयार: अच्छी तरह से उपयोग ImageJ के ओपन छवि: → ओपन → (फ़ाइल का पता लगाने और चयन) फ़ाइल। छवि (ओं) 8-बिट या 16-बिट है कि सुनिश्चित करें। छवि का चयन करके छवि के लिए सीमा को समायोजित करें तो समायोजित करें और चुनें दहलीज पर क्लिक करें। "सीमा खिड़की" (चित्रा 3) का निरीक्षण करें। "डार्क पृष्ठभूमि" विकल्प की जाँच करें। "लाल" का चयन करें और छवि में प्रत्येक कोशिका एक लाल बिंदी (स्केल में देखा जाएगा कवर किया जा रहा नहीं कर रहे हैं कि कोशिकाओं, चित्रा 3 बी) के साथ चिह्नित है जब तक (काला तीर देखें) कम सीमा के स्तर में वृद्धि। कम सीमा के रूप मेंकुछ कोशिकाओं अगोचर हो जाएगा वृद्धि हुई है। यह कम सीमा निर्धारित करने के लिए कितनी दूर के लिए सूचक हो सकता है। नोट: कभी कभी कोशिकाओं के समूहों हल नहीं किया जा सकता है और कण काउंटर से एक के रूप में गिना जाएगा। ऐसे मामलों में, एक क्लस्टर में कोशिकाओं की संख्या छवि की जांच (यदि आवश्यक में ज़ूम) और मैनुअल गिनती एक मिलान काउंटर का उपयोग करके अनुमान लगाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, कम सीमा कोशिकाओं के समूहों को हल करने के लिए बढ़ाया जा सकता है; इस हेरफेर से उत्पन्न किसी भी अगोचर कोशिकाओं तो एक मिलान काउंटर का उपयोग कर गिना जा सकता है। ImageJ का उपयोग सेल संख्या का विश्लेषण: कोशिकाओं (चित्रा 3 सी) की गिनती करने के कण विश्लेषक लॉन्च। विश्लेषण का चयन करें और कण का विश्लेषण करें पर क्लिक करें। वैकल्पिक रूप से कणों एल्गोरिथ्म गिनती (चित्रा 3 डी) देखने के लिए "ओवरले रूपरेखा" का चयन करें। वैकल्पिक रूप से, एक इकाई के आकार या पिक्सेल क्षेत्र के लिए एक सीमा निर्धारित (जैसे।, सेल, एल्गोरिथ्म के लिए कोशिकाओं, आदि) के पेड़ों का झुरमुट गिनती करने के लिए। ठीक क्लिक करें। गिनती (3E चित्रा) के साथ एक सारांश खिड़की का निरीक्षण करें। 2. hemocyte अशांति परख Hemocytes, का चयन लार्वा को परेशान और कांच के मोती (212-600 माइक्रोन) का लगभग 0.5 जी के साथ एक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में उन्हें जगह और 0.5 मिलीलीटर पानी जोड़ें। 1 मिनट के लिए गति 10 पर, हाथ से, ट्यूब भंवर। एक पेट्री डिश में microcentrifuge ट्यूब की सामग्री spilling और एक तूलिका के साथ लार्वा बाहर उठा कर कांच के मोती से लार्वा निकालते हैं। वसूली चरण के लिए, मक्खी भोजन की थोड़ी मात्रा के साथ पहले से तैयार पेट्री डिश में लार्वा जगह है। लार्वा 45 मिनट का या वांछित के रूप में एक अवधि के लिए उनकी hemocyte पैटर्न को फिर से स्थापित करने की अनुमति दें। नोट: वे इस प्रक्रिया में मृत्यु हो गई है, के रूप में जा बंद कर दिया है कि किसी भी लार्वा त्यागें। हालांकि, हम आम तौर पर एल देखनेittle क्षति vortexing के 1 मिनट के बाद (नीचे देखें और पूरक चित्रा 1)। धारा 1 में ऊपर वर्णित के रूप में वसूली की अवधि के बाद, भरो / परिमार्जन परख के साथ जारी है।

Representative Results

वर्णित विधियों के विशिष्ट परिणामों को वर्णन करने के लिए, हम पहले लार्वा hemocyte नंबर की प्रगति और लार्वा विकास के पाठ्यक्रम पर उनके निवास (चित्रा 4) की रूपरेखा तैयार करने के लिए hemocyte भरो / परिमार्जन परख का इस्तेमाल किया। निवासी और लार्वा hemocyte आबादी घूम एकल लार्वा से अलग थे (HML Δ-Gal4, यूएएस GFP, वह-Gal4 लेबल करने के लिए विशाल लार्वा hemocytes के बहुमत) और ImageJ का उपयोग मात्रा। लार्वा के साथियों (~ 48 घंटा AEL या 1 सेंट इनस्टार), 2.5 मिमी (~ 80 घंटा AEL या देर से 2 एन डी instar), और 3.5 मिमी (~ 96 घंटा AEL या 3 Rd instar) की जांच कर रहे थे (चित्रा 4) 1.2 मिमी आकार । Hemocyte संख्या के साथ correlating और डाई दाग लार्वा 7 और लार्वा छल्ली 6 के माध्यम से फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबल hemocytes का जीना मतगणना के प्रकाश माइक्रोस्कोपी के आधार पर पिछले अनुमान से अधिक है, लार्वा विकास के पाठ्यक्रम पर विस्तार किया। 1 सेंट इन मेंघूम hemocytes के अंश का उत्तरोत्तर पिछले प्रकाशनों 6.7 के साथ संगत लार्वा विकास के पाठ्यक्रम (चित्रा 4 बी, सी), में वृद्धि हुई है, जबकि टार लार्वा लगभग सभी hemocytes, निवासी थे। अगले हम विधि ईमानदारी निवासी और घूम आबादी के बीच hemocytes के संक्रमण पर नजर रखता है कि क्या जांच की। निवासी hemocytes क्षणिक यांत्रिक गड़बड़ी के द्वारा अलग किया जा सकता है और वे अपने निवासी साइटों अनायास से 6-पालन कर रहे हैं कि घटना का लाभ उठाते हुए, हम hemocyte अशांति परख में वर्णित के रूप में कांच के मोती के साथ vortexing द्वारा निवासी hemocytes छितरी हुई है। दरअसल, लार्वा के यांत्रिक गड़बड़ी के निवासी hemocytes की कीमत (चित्रा 5) में hemocytes घूम की आबादी में एक नाटकीय वृद्धि हुई है। 45 मिनट की एक वसूली की अवधि के बाद, hemocytes काफी हद तक दृश्य निरीक्षण से और के रूप में दोनों के द्वारा, उनके अनुयायी राज्य को लौट गया थाघूम कोशिकाओं के sessed प्रतिशत (चित्रा 5 डी, ई)। जैसी कि उम्मीद थी, कुल hemocyte संख्या घूम और निवासी आबादी के बीच hemocytes की पारी के बावजूद समय पर स्थिर बने रहे। कई अतिरिक्त बातों को ध्यान में रखा गया। कांच के मोती विभिन्न समय अवधि (1, 5, 20 मिनट) के लिए trypan नीले (सिग्मा) की उपस्थिति में प्रदर्शन किया गया था के साथ vortexing, प्रमुख ऊतकों को नुकसान का कारण नहीं था कि vortexing पुष्टि करने के लिए। 20 मिनट vortexing सकारात्मक नियंत्रण (पूरक चित्रा 1) के रूप में इस्तेमाल सुई टांके की वजह से नुकसान जैसी क्षति के छोटे क्षेत्रों में हुई है, जबकि दोनों 1 और 5 मिनट vortexing, किसी भी स्पष्ट ऊतक व्यवधान का कारण नहीं था। एपिडर्मिस या छल्ली क्षति के बिना अन्य ऊतकों के आंतरिक नुकसान बाहर नहीं किया जा सकता है, इस परिदृश्य लार्वा अखंडता समझौता नहीं था, सुझाव 1 मिनट और 5 मिनट के इलाज लार्वा फिर से पालन उम्मीद पैटर्न और समय सीमा में की hemocytes रूप में नहीं बल्कि संभावना नहीं लगतीडी (पूरक चित्रा 1)। इसके विपरीत, लार्वा फिर से आसंजन की कमी से पीड़ित 20 मिनट के लिए vortexed, और पहले 14 में वर्णित किया गया है के रूप में भी, एपिडर्मल घाव साइटों के लिए hemocytes घूम की कुर्की नहीं दिखा था। अन्त में, विधि के reproducibility प्रदर्शित करने के लिए, हम अलग प्रयोगकर्ताओं द्वारा आयोजित की गई जिसके ऊपर दो प्रयोगों से 2.5 मिमी लार्वा की जैविक प्रतिकृति की तुलना में। पूरक चित्रा 2 में सचित्र, दोनों साथियों तुलनीय कुल लार्वा प्रति hemocytes की संख्या, और घूम hemocytes का प्रतिशत दिखाया। छात्र के टी परीक्षण विधि प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और मोटे तौर पर लागू है, सुझाव है कि कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर दिखाया। चित्रा 1. hemocyte भरो / परिमार्जन और अशांति परख रों etup और योजनाबद्ध। (ए) एकल छवि स्लाइड सेटअप: एक 5X उद्देश्य के साथ इमेजिंग के लिए पांच 2mm वर्गों (बी) टाइल स्कैन स्लाइड सेटअप:। इमेजिंग खून के लिए चार 3 मिमी चौकों / एक टाइल स्कैन माइक्रोस्कोप के साथ ≤2.5 मिमी लार्वा की scrapes। इमेजिंग के लिए अनुशंसित उद्देश्यों 5x या 10x। (सी) / ImageJ का उपयोग परिमार्जन परख योजनाबद्ध और जिसके परिणामस्वरूप quantifications भरो। (डी) अशांति परख में हैं, hemocyte पैटर्न यंत्रवत् कांच के मोती के साथ लार्वा vortexing से बाधित है। लार्वा hemocytes Hematopoietic जेब के लिए फिर से पालन के दौरान जो 45 मिनट की अवधि में ठीक करने के लिए अनुमति दी जाती है। hemocytes के चिपकने वाला गुण अशांति के बाद प्रचलन में hemocytes का प्रतिशत बढ़ाता, इस विधि द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। तरीके "> चित्रा 2. भरो / परिमार्जन परख घूम और निवासी hemocytes जारी करने के लिए। (ए) एक लार्वा खून करने के लिए, लार्वा के पीछे और पूर्वकाल सिरों पर उदर चीरों (कैंची प्रतीक) बना रहे हैं। (बी) hemocytes चीरों से बाहर प्रवाह और स्लाइड की सतह पर निपटा जाएगा संचलन में। (सी) लसीका ग्रंथि (एलजी) स्थित है और यह puncturing के बिना, नीचे टिकी है। निवासी hemocytes jabbing और / या एक सुई के साथ लार्वा scraping द्वारा जारी किया जाता है। स्लाइड पर (डी) निवासी hemocytes। (ई, एफ) सभी निवासी hemocytes जारी कर रहे हैं जब तक परिमार्जन प्रक्रिया को दोहराया है। बरकरार लसीका ग्रंथि युक्त लार्वा शव के पीछे छोड़ दिया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। <p class="jove_content" fo: रख-together.within-पेज = "हमेशा"> चित्रा 3. ImageJ का उपयोग hemocytes की मात्रा का ठहराव स्वचालित। (ए, बी) ImageJ में एक hemocyte छवि फ़ाइल खोलने के बाद, कम सीमा स्तर छवि में सभी कोशिकाओं के लिए खाते में समायोजित किया जाता है। (सी, डी) कणों सेल पिक्सेल आकार, घेरा, और परिणाम readout स्थापित करने की आवश्यकता का विश्लेषण करें प्रारूप (जैसे, ओवरले रूपरेखा)। (ई) hemocytes की संख्या प्रदर्शित सारांश विंडो। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 4. प्रतिनिधि परिणाम (1)। Hemocyte नंबर और अधिक से अधिक निवासी राज्य लार्वा विकास के पाठ्यक्रम। (ए) का इस्तेमाल किया लार्वा चरणों का अवलोकन; 1 सेंट instar (48 घंटा AEL; ~ 1.2 मिमी लंबाई); 2 एन डी instar (80 घंटा AEL; 2.5 मिमी लंबाई); 3 instar (96 घंटा AEL; ~ 3.5 मिमी लंबाई)। जीनोटाइप HML Δ-Gal4, यूएएस GFP है; उन्होंने कहा-Gal4। चरणों लार्वा mouthhooks का आकलन करने से पुष्टि की गई। संबंधित लार्वा चरणों में घूम और निवासी hemocyte संख्या (बी) दंड चित्र। Hemocytes घूम (सी) का प्रतिशत। घूम hemocytes के अंश का लार्वा विकास के पाठ्यक्रम पर disproportionally बढ़ जाती है कि ध्यान दें। (डी) कुल hemocytes, लार्वा प्रति घूम और निवासी hemocytes का योग से उत्पन्न। Hemocytes भरो / परिमार्जन विधि का उपयोग मात्रा निर्धारित किया गया; n ≥ 6 लार्वा / स्थिति, त्रुटि सलाखों के मानक विचलन, 3 स्वतंत्र दोहराने के प्रयोगों में इस बात की पुष्टि निष्कर्षों दिखा।JPG "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 5. प्रतिनिधि परिणाम (2)। Hemocyte निवास पर यांत्रिक गड़बड़ी के प्रभाव। (एसी) से पहले और 45 मिनट वसूली के द्वारा पीछा कांच के मोती, साथ vortexing के बाद एक लार्वा का उदाहरण (क) कोई अशांति नियंत्रण। hemocytes Hematopoietic जेब में स्थानीय कर रहे हैं (बी) बाधित hemocyte पैटर्न 0 मिनट पर कांच के मोती और पानी का एक निलंबन में लार्वा vortexing के बाद वसूली के बाद अशांति की 45 मिनट पर (सी) hemocyte पैटर्न।। कई hemocytes Hematopoietic जेब के लिए दूसरी जगह है; बढ़े हुए पृष्ठीय पोत जुड़े समूहों और जल्दी के बाद अशांति संचय (तीर) के प्रमुख साइटों रहे हैं जो पृष्ठीय धारियों ध्यान दें। जीनोटाइप HML Δ-Gal4, यूएएस GFP है; उन्होंने कहा-Gal4 एक्स YW। भरो / परिमार्जन विधि द्वारा मात्रा hemocytes घूम (डी) प्रतिशत। (ई) कुल hemocytes, लार्वा प्रति घूम और निवासी hemocytes का योग से उत्पन्न। n ≥ 4 लार्वा / स्थिति, त्रुटि सलाखों के मानक विचलन, 3 स्वतंत्र दोहराने के प्रयोगों में इस बात की पुष्टि निष्कर्षों दिखा। छात्र के टी-परीक्षण महत्व की पुष्टि के लिए, एन एस (महत्वपूर्ण नहीं), ** (0.05 ≤ पी), ** (0.01 ≤ पी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहाँ, हम मात्रात्मक एकल ड्रोसोफिला लार्वा से निवासी और घूम रक्त कोशिकाओं को ठीक है, और इन दो hemocyte आबादी यों की पहली विधि का वर्णन है। प्रोटोकॉल इमेजिंग और स्वचालित सेल गिनती के द्वारा पीछा घूम और निवासी रक्त कोशिकाओं के अनुक्रमिक रिहाई, शामिल हैं। 60 मिनट वसूली की अवधि ⁶ – लारवल निवासी hemocytes क्षणिक, यांत्रिक गड़बड़ी से संचलन में मोटे तौर पर एक 30 के भीतर उलट हो जाता है एक प्रक्रिया है कि जुटाए जा सकता है। तदनुसार, इस प्रोटोकॉल को दो तरह से परीक्षण किया गया था, (1) लार्वा और लार्वा विकास के पाठ्यक्रम पर hemocytes घूम के अंश प्रति कुल hemocyte नंबर का आकलन करने से, और (2) प्रयोगात्मक एक स्वचालित पद्धति का उपयोग करके निवासी hemocytes dislodging से, जो की पुष्टि hemocyte स्थानीयकरण और निवासी में hemocyte संख्या और घूम आबादी के तंग सहसंबंध। इसके अलावा, विधि के reproducibility सह द्वारा प्रदर्शन किया गयाजैविक प्रतिकृति के दो डेटासेट mparing।

अतीत में, प्रयोगशालाओं लार्वा hemocytes ^6,13,21 यों की तकनीक की एक सीमा का इस्तेमाल किया है। इस प्रोटोकॉल पुनः प्राप्त करने और एक आसानी से निभा मंच प्रदान करने, ड्रोसोफिला लार्वा से निवासी और घूम रक्त कोशिका आबादी यों की एक आम मानक स्थापित करता है। वर्णित विधि निवासी hemocytes और उनके microenvironment की भूमिका पर ध्यान केंद्रित है कि अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है, hematopoietic ^4-6 जेब, और फ्लोरोसेंट प्रोटीन जंगली प्रकार में transgene-ले जाने के ड्रोसोफिला तनाव और आनुवंशिक रूप से संशोधित पृष्ठभूमि का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है। प्रोटोकॉल भी निवासी hemocytes या ⁽⁴ में समीक्षा) कुल hemocyte संख्या में परिवर्तन की लामबंदी से चलाता है कि प्रतिरक्षा चुनौती या चोट, और आनुवंशिक रूप से या पर्यावरण की दृष्टि से प्रेरित संकेतन के बाद hemocyte लामबंदी पर ध्यान केंद्रित है कि अध्ययन के लिए प्रासंगिक है। यह समय से पहले di के मामलों में ध्यान दिया जाना चाहिएलसीका ग्रंथि प्रजातियों बनाम भ्रूण / लार्वा भेद fferentiation और लसीका ग्रंथि से hemocytes की रिहाई के लिए प्रयोग किया जाता फ्लोरोसेंट hemocyte रिपोर्टर की अभिव्यक्ति पैटर्न द्वारा सीमित किया जा सकता है।

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल इमेजिंग रहते हैं, fluorescently लेबल hemocytes पर निर्भर करता है। भविष्य में, यह immunocytochemistry का उपयोग कर, जैसे, निर्धारण के बाद जारी की कोशिकाओं का पता लगाने की अनुमति के लिए संशोधित किया जा सकता है। विधि hemocytes की बहाली और उनके हेरफेर पूर्व अनुमति देता है के बाद से इस मामले में, प्रोटोकॉल आसंजन ऊष्मायन बार बढ़ रही है, और इस तरह के concanavalin ए, के रूप में चिपकने वाला स्लाइड कोटिंग जोड़कर उदाहरण के लिए रक्त कोशिकाओं की पूरी आसंजन, यह सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित किया जाना पड़ सकता विवो, यह विकास, सेल जैविक और जैव रासायनिक अध्ययन की एक विस्तृत रेंज को फायदा होगा। निवासी और घूम रक्त कोशिकाओं सभी ड्रोसोफिला के postembryonic विकास के चरणों और अन्य अकशेरुकी ^22, suggesti के दौरान पाए जाते हैंएनजी इस विधि की है कि अनुकूलन ड्रोसोफिला लार्वा hematopoietic प्रणाली से परे अध्ययन की एक विस्तृत रेंज को फायदा होगा।

Materials

6cm/9cm Petri dishes			One for each genotype to be evaluated
Water squirt bottle
Metal spoon/spatula
Thin paintbrush			e.g. a "liner"
Glass cavity dish
PAP pen: Super PAP PEN IM3580	Beckman Coulter
Glass slides			Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; e.g. 2mm squares.
Moist chamber			This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom
Schneider’s Drosophila cell culture media	Invitrogen
Cold block			This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color
Two 1ml syringes with needles (27G ½)	Becton Dickinson		For dissections.
Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2mm)	Fine Science Tools
Glass beads, 212-600 micron	Sigma
2 ml Eppendorf tubes	Eppendorf		One per genotype evaluating
Vortex Mixer	Fisher Scientific
Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes. Suitable transgenes include: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski et al., 2007), or HmlΔ-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes.
Fluorescence dissecting microscope	Leica		Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module
Inverted fluorescence microscope with camera attachment	Leica or Keyence		With or without tile scanning function (eg. Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series)