Dois fótons de imagem de cálcio intracelular<sup> 2+</sup> Manuseio e produção de óxido nítrico no endotélio e músculo liso células de uma aorta de rato isolada
Summary
Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.
Abstract
O cálcio é um regulador muito importante de diversos processos fisiológicos em tecidos vasculares. A maioria das funções endoteliais e do músculo liso dependem muito alterações de cálcio intracelular ([Ca 2+] i) e óxido nítrico (NO). A fim de entender como [Ca2 +] i, NO e moléculas jusante são manipulados por um vaso sanguíneo em resposta a vasoconstritores e vasodilatadores, desenvolvemos uma nova técnica que se aplica a rotulagem de cálcio (ou NO-rotulagem) tinge com microscopia de dois fótons para medir a manipulação de cálcio (ou nenhuma produção) nos vasos sanguíneos isolados. Aqui descrito é um procedimento passo-a-passo que demonstra como isolar uma aorta de um rato, etiqueta de cálcio ou NO nas células endoteliais ou de músculo liso, e imagem transientes de cálcio (ou a produção de NO), usando um microscópio de dois fotões seguinte fisiológico ou estímulos farmacológicos. As vantagens da utilização do método são multi-dobra: 1) é possível simultânealy medir transientes de cálcio em ambas as células endoteliais e células musculares lisas em resposta a diferentes estímulos; 2) que permite que uma imagem de células endoteliais e células do músculo liso na sua configuração nativa; 3) este método é muito sensível ao cálcio intracelular ou nenhumas mudanças e gera imagens de alta resolução para medições precisas; e 4) abordagem descrita pode ser aplicada para a medição de outras moléculas, tais como espécies de oxigénio reactivas. Em resumo, a aplicação de microscopia de emissão de laser de dois fotões para monitorar transientes de cálcio e a produção de NO nas células endoteliais e do músculo liso de um vaso sanguíneo isolado forneceu dados quantitativos de alta qualidade e promoveu a nossa compreensão dos mecanismos que regulam a função vascular.
Introduction
O cálcio é um segundo mensageiro fundamental dentro da células vasculares tais como células endoteliais e do músculo liso. É o estímulo primário para a contracção vascular e desempenha um papel importante na dilatação vascular, incluindo os seus efeitos através de nenhuma geração dentro do endotélio. Devido às limitações da tecnologia de imagem, tem sido praticamente impossível observar manuseamento de cálcio no interior do vaso intacto. O desenvolvimento de dois sistemas de imagem de fótons e da criação de novos cálcio ou sem corantes de rotulagem, torna possível a imagem a uma profundidade e resolução suficiente para começar a entender a dinâmica de cálcio e produção de NO na vasculatura.
Dois microscopia de fotões foi recentemente aplicada em tecidos, órgãos e estudos em animais inteiros, mesmo devido à sua superior capacidade para penetrar profundamente tecidos com baixa fluorescência de fundo e a sensibilidade do sinal de alta 1,2. O espectro estreito de dois fotões de excitação no Illuminatião ponto focal e a utilização de detectores não-descanned são as razões pelas quais microscopia dois fotões é superior a microscopia confocal tradicional. A microscopia confocal não pode produzir imagens de alta qualidade a uma profundidade de tecido necessária devido à auto-fluorescência e dispersão de luz fora de foco no pinhole confocal. Por conseguinte, temos desenvolvido um método usando um microscópio de dois fotões para medir a [Ca2 +] i de sinalização e a produção de NO em células dos vasos sanguíneos individuais intactas com alta resolução e baixa relação de sinal-para-ruído.
Protocol
Representative Results
Discussion
Visão geral Experimental. Para melhor compreender a contribuição de cálcio e NÃO a fisiologia vascular, um novo método foi desenvolvido para medir [Ca2 +] i e NÃO dentro do músculo liso e células endoteliais de aortas intactas isoladas. Juntos, este protocolo é composto por estes passos críticos: 1) o isolamento mecânico e preparação (digestão enzimática não) da embarcação. É importante manter o tecido saudável e intacta, tanto quanto possível obter gravações fisiol…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. William Cashdollar, ea Northwestern Mutual Foundation Imaging Center do Instituto de Pesquisa Wisconsin sangue para obter ajuda com os estudos de imagem. Agradecemos também o Dr. Daria Ilatovskaya para a leitura crítica deste manuscrito e discussão útil. Este estudo foi financiado pelo National Institutes of Health Grants HL108880 (como) e DP2-OD008396 (a AMG).
Materials
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo 4 AM | Life Technologies | F14217 | 500µl in DMSO |
| Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-Name | Tocris | 0665 | |
| Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm | |
| Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 to 540 nm |
| 25× water-immersion objective lens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 and working distance 2 mm |
| Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
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