Deux photons imagerie intracellulaire de Ca<sup> 2+</sup> Manipulation et production d'oxyde nitrique endothélial et en cellules de muscle lisse d'un Rat aorte isolée
Summary
Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.
Abstract
Le calcium est un régulateur important de nombreux processus physiologiques dans les tissus vasculaires. La plupart des fonctions endothéliales et musculaires lisses dépendent fortement des changements de calcium intracellulaire ([Ca 2+] i) et de l'oxyde nitrique (NO). Afin de comprendre comment [Ca 2+] i, NO et des molécules en aval sont traitées par un vaisseau sanguin en réponse à des vasoconstricteurs et vasodilatateurs, nous avons développé une nouvelle technique qui applique calcium-étiquetage (ou NO-étiquetage) colorants comportant deux microscopie photonique à mesurer la manipulation de calcium (ou de la production de NO) dans les vaisseaux sanguins isolés. Décrit ici est une procédure détaillée étape par étape qui montre comment isoler une aorte d'un rat, l'étiquette de calcium ou de NO dans les cellules endothéliales ou musculaires lisses, et l'image transitoires de calcium (ou la production de NO) à l'aide d'un microscope à deux photons suivante physiologique ou des stimuli pharmacologiques. Les avantages de l'utilisation de la méthode sont multiples: 1) il est possible d'simultanély mesurer les transitoires de calcium dans les cellules endothéliales et les cellules des muscles lisses en réponse à différents stimuli; 2) elle permet de cellules endotheliales de l'image et des cellules musculaires lisses dans leur milieu d'origine; 3) cette méthode est très sensible au calcium intracellulaire ou pas de changements et génère des images à haute résolution pour des mesures précises; et 4) approche décrite peut être appliquée à la mesure d'autres molécules, telles que les espèces réactives de l'oxygène. En résumé, l'application de deux microscopie biphotonique d'émission laser pour contrôler les transitoires de calcium et la production de NO dans les endothéliales et musculaires lisses des cellules d'un vaisseau sanguin isolé a fourni des données quantitatives de haute qualité et de la promotion de notre compréhension des mécanismes de régulation de la fonction vasculaire.
Introduction
Le calcium est un second messager fondamental à l'intérieur de cellules vasculaires tels que des cellules endotheliales et des muscles lisses. Il est le stimulus primaire pour la contraction vasculaire et joue un rôle majeur dans la dilatation vasculaire, y compris ses effets par le biais de la production de NO dans le endothélium. En raison des limites des technologies d'imagerie, il a été pratiquement impossible d'observer la manipulation de calcium dans le récipient intact. Le développement de deux systèmes d'imagerie photonique et la création de nouvelles calcium ou pas de colorants d'étiquetage, il est possible de l'image à une profondeur et une résolution suffisantes pour commencer à comprendre la dynamique de calcium et la production de NO dans le système vasculaire.
La microscopie à deux photons a récemment été appliquée dans les tissus, les organes et les études sur les animaux entiers, même en raison de sa capacité supérieure pour pénétrer profondément les tissus à faible fluorescence de fond et de la sensibilité du signal haute. 1,2 Le spectre étroit de deux excitation photonique au illumination point focal et l'utilisation de détecteurs non-descanned sont les raisons pour lesquelles les deux microscopie photon est supérieure à la microscopie confocale traditionnelle. La microscopie confocale ne peut pas produire des images de haute qualité à la profondeur de tissu nécessaire en raison de l'auto-fluorescence et la diffusion de la lumière hors-focus dans le sténopé confocal. Par conséquent, nous avons développé une méthode utilisant un microscope à deux photons pour mesurer [Ca 2+] i la signalisation et la production de NO dans les cellules intactes, individuels des vaisseaux sanguins avec une résolution élevée et un faible rapport signal sur bruit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Présentation expérimentale. Pour mieux comprendre la contribution de calcium et NON à la physiologie vasculaire, une nouvelle méthode a été développée pour mesurer [Ca 2+] i et de NO dans les cellules musculaires lisses et endothéliales des aortes intactes isolées. Ensemble, ce protocole se compose de ces étapes critiques: 1) l'isolement et la préparation mécanique (digestion enzymatique pas) du navire. Il est important de garder le tissu sain et intact autant que possible…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr William Cashdollar, et le Centre Foundation Imaging Northwestern Mutual à l'Institut de recherche de sang du Wisconsin de l'aide pour les études d'imagerie. Nous remercions également le Dr Daria Ilatovskaya pour la lecture critique de ce manuscrit et de discussion utile. Cette étude a été soutenue par les National Institutes of Health des subventions HL108880 (AS) et DP2-OD008396 (à AMG).
Materials
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo 4 AM | Life Technologies | F14217 | 500µl in DMSO |
| Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-Name | Tocris | 0665 | |
| Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm | |
| Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 to 540 nm |
| 25× water-immersion objective lens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 and working distance 2 mm |
| Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
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